基礎(chǔ)生物化學(xué)實驗

內(nèi)容概要

　　分實驗理論和學(xué)生實驗兩個部分。實驗理論部分涉及最基本的實驗技術(shù)及原理和實驗方法的介紹。學(xué)生實驗部分選用包括糖類、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸、酶、代謝中最基本的實驗和一些訓(xùn)練生物化學(xué)基本技術(shù)和基本方法的實驗及綜合實驗。書后附有實驗室基本操作、常用儀器的使用方法、常用試劑的配制等附錄?！　〉?版精簡或刪除了一些目前已不常用的方法介紹和實驗。增加了近年發(fā)展起來的生物化學(xué)新技術(shù)、新方法和新儀器，以及一些與現(xiàn)代科學(xué)研究、醫(yī)學(xué)、農(nóng)林等應(yīng)用密切相關(guān)的新實驗。并增加了一些綜合設(shè)計實驗。在實驗編寫風(fēng)格方面，更突出基礎(chǔ)、簡明、實用、系統(tǒng)。對實驗中應(yīng)注意的地方、學(xué)生在實驗過程中易出現(xiàn)的問題、加入關(guān)鍵試劑應(yīng)有的正常現(xiàn)象、部分儀器的正確操作等都加強(qiáng)了提示和指導(dǎo)。

書籍目錄

第一篇常用生物化學(xué)實驗技術(shù)及原理 第一章層析技術(shù) 第二章電泳技術(shù) 第三章光譜技術(shù) 第四章離心技術(shù) 第五章膜技術(shù)及其在生物化學(xué)中的應(yīng)用 第六章蛋白質(zhì)的分離純化和檢測 第七章蛋白質(zhì)的分析技術(shù) 第八章臨床生物化學(xué)檢驗 第二篇學(xué)生實驗 第九章糖類的化學(xué) 實驗一糖類的性質(zhì)實驗（一）——糖類的顏色反應(yīng) Ⅰ.α—萘酚反應(yīng)（Molisch反應(yīng)） Ⅱ.間苯二酚反應(yīng)（Seliwanoff反應(yīng)） 實驗二糖類的性質(zhì)實驗（二）——糖類的還原作用 實驗三總糖的測定——蒽酮比色法 實驗四還原糖的測定——3，5—二硝基水楊酸比色法 實驗五血糖的定量測定——GOD—PAP法 第十章脂質(zhì)的化學(xué) 實驗六粗脂肪的提取和定量測定 實驗七脂肪碘值的測定 實驗八血清膽固醇的測定 Ⅰ.化學(xué)比色法——磷硫鐵法 Ⅱ.化學(xué)比色法——鄰苯二甲醛法 Ⅲ.酶法 第十一章蛋白質(zhì)的化學(xué) 實驗九總氮量的測定——凱氏（Micro—Kjeldahl）定氮法 實驗十氨基酸的分離鑒定一一紙層析法 實驗十一蛋白質(zhì)的性質(zhì)實驗（一）一一蛋白質(zhì)及氨基酸的呈色反應(yīng) Ⅰ.雙縮脲反應(yīng) Ⅱ.茚三酮反應(yīng) Ⅲ.黃色反應(yīng) Ⅳ.考馬斯亮藍(lán)反應(yīng) 實驗十二蛋白質(zhì)的性質(zhì)實驗（二）——蛋白質(zhì)等電點的測定和蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng) Ⅰ.蛋白質(zhì)等電點的測定 Ⅱ.蛋白質(zhì)的沉淀與變性 Ⅲ.尿蛋白定性檢驗 實驗十三蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的測定（一）——SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳 實驗十四蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的測定（二）——凝膠過濾法 實驗十五蛋白質(zhì)濃度的測定 Ⅰ.考馬斯亮藍(lán)G—250法（Bradford法）測定蛋白質(zhì)的濃度 Ⅱ.用福林一酚試劑法（Lowry法）測定蛋白質(zhì)的濃度 實驗十六酪蛋白的制備 第十二章核酸的化學(xué) 實驗十七大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取、酶切和瓊脂糖凝膠電泳鑒定 實驗十八肝細(xì)胞核中核酸（RNA和DNA）的分離與測定 實驗十九薄層層析法分離AMP、ADP和ATP 實驗二十紫外分光光度法測定核酸含量 實驗二十一應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA分子 第十三章酶和維生素 實驗二十二酶的特性 Ⅰ.溫度對酶活力的影響 Ⅱ.pH對酶活力的影響 Ⅲ.唾液淀粉酶的活化和抑制 Ⅳ.酶的專一性 實驗二十三枯草桿菌蛋白酶活力測定 實驗二十四底物濃度對酶促反應(yīng)速率的影響——米氏常數(shù)的測定 實驗二十五胰凝乳蛋白酶的制備及活力測定 實驗二十六維生素C的定量測定 Ⅰ.2，4—二硝基苯肼法 Ⅱ.熒光法 實驗二十七維生素A的定量測定 Ⅰ.三氯化銻法 Ⅱ.紫外分光光度法 第十四章新陳代謝 實驗二十八肌糖原的酵解作用 實驗二十九小麥萌發(fā)前后淀粉酶活力的比較 實驗三十發(fā)酵過程中無機(jī)磷的利用 實驗三十一脂肪酸的β—氧化 實驗三十二血液中轉(zhuǎn)氨酶活力的測定 實驗三十三組織中乳酸脫氫酶同工酶的活性染色 第十五章綜合實驗 實驗三十四堿性磷酸酶的分離純化及其特性研究 Ⅰ.堿性磷酸酶的分離純化及各級分 酶活性和蛋白含量的測定 Ⅱ.堿性磷酸酶的純度、蛋白印跡鑒定及其亞基相對分子質(zhì)量測定 Ⅲ.堿性磷酸酶的酶學(xué)特性研究 實驗三十五溶菌酶的提取和系列性質(zhì)測定 Ⅰ.溶菌酶的分離純化 Ⅱ.溶菌酶分離純化參數(shù)的測定 Ⅲ.SDS—PAGE鑒定純化產(chǎn)物的純度和測定溶菌酶的相對分子質(zhì)量 Ⅳ.溶菌酶的酶學(xué)特性研究 Ⅴ.分子篩層析測酶相對分子質(zhì)量 附錄 一、實驗室基本操作 二、試劑的配制及其分級 三、實驗誤差的統(tǒng)計學(xué)處理 四、硫酸銨飽和度計算表 五、常用核酸、蛋白質(zhì)換算數(shù)據(jù) 六、氨基酸符號及相應(yīng)密碼子 七、常見酸堿試劑的濃度及密度 八、常用緩沖液的配制 九、常用酸堿指示劑 十、離心機(jī)轉(zhuǎn)速與相對離心力的換算 十一、層析中常用介質(zhì)的規(guī)格及性能 參考文獻(xiàn)

章節(jié)摘錄

版權(quán)頁：   插圖：   6.蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分析技術(shù) 監(jiān)測蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的手段很多，一般實驗室常用的手段是紫外差吸收光譜、熒光光譜和圓二色光譜等。紫外差吸收光譜一般利用雙光路紫外／可見光譜儀，以天然蛋白為對照，測定變性或復(fù)性蛋白的紫外吸收光譜與天然蛋白的紫外吸收光譜的差譜，它主要反映蛋白質(zhì)在變性或復(fù)性過程中整體空間構(gòu)象的變化。 熒光光譜利用蛋白質(zhì)中的芳香族氨基酸（酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸）殘基的側(cè)鏈基團(tuán)具有吸收紫外區(qū)域的入射光從而發(fā)射熒光的特性，來研究蛋白質(zhì)在變性或復(fù)性過程中整體空間構(gòu)象的變化。其基本機(jī)理是：熒光來源于生色團(tuán)基團(tuán)在不同電子能級之間的躍遷，熒光頻率取決于能級之間的能量差，生色團(tuán)基團(tuán)與周圍基團(tuán)的相互作用可能會改變其處于激發(fā)態(tài)時所具有的能量，從而改變其發(fā)射熒光的頻率與強(qiáng)度。同一種熒光分子在不同極性的環(huán)境中，其最大吸收波長λmax可能會有所差別。一般來說，極性環(huán)境會影響生色團(tuán)基團(tuán)的基態(tài)和激發(fā)態(tài)能級，減少激發(fā)態(tài)的能量，從而引起發(fā)射譜的紅移（使λmax增大）。在天然的蛋白質(zhì)中，可產(chǎn)生熒光的芳香族氨基酸分子多處于蛋白質(zhì)的內(nèi)部，被多種非極性氨基酸殘基包圍，因此其所處的局部小環(huán)境的極性弱于蛋白質(zhì)分子外部水溶液的極性。蛋白質(zhì)變性過程中，芳香族氨基酸分子的側(cè)鏈基團(tuán)逐漸暴露于水溶液中，其所處的環(huán)境極性逐漸增加，因此蛋白質(zhì)熒光發(fā)射峰的λmax逐漸增大，λmax紅移的程度可以反映蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的程度，紅移程度越大，則表明蛋白質(zhì)在變性過程中構(gòu)象變化的程度越大。反過來，蛋白質(zhì)復(fù)性過程中，芳香族氨基酸分子的側(cè)鏈逐漸內(nèi)埋于蛋白質(zhì)內(nèi)部，其所處的環(huán)境極性逐漸降低，因此蛋白質(zhì)熒光發(fā)射峰的λmax逐漸減小，稱為λmax的藍(lán)移。通過測定蛋白質(zhì)λmax藍(lán)移的程度，可以推算其整體構(gòu)象變化的程度。 圓二色光譜主要用以研究蛋白質(zhì)在變性（復(fù)性）過程中二級結(jié)構(gòu)的變化。其基本原理請參考相關(guān)文獻(xiàn)。由于各種蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)（例如a螺旋、β折疊等）均具有特定的圓二色譜，各種二級結(jié)構(gòu)對總譜的貢獻(xiàn)具有加和效應(yīng)，而三級結(jié)構(gòu)對圓二色譜的貢獻(xiàn)為零，所以由圓二色譜可以確定蛋白質(zhì)或多肽的二級結(jié)構(gòu)，該方法實際上是確定蛋白質(zhì)或多肽中處于各種二級結(jié)構(gòu)的氨基酸殘基數(shù)的百分比。蛋白質(zhì)在變性和復(fù)性的過程中，其圓二色譜的變化可以直接反映蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的變化，一般來說，蛋白質(zhì)變性的程度越大，在200～250 nm范圍內(nèi)，其圓二色譜更加接近基線（橢圓率為零的直線）。 蛋白質(zhì)變性和復(fù)性的研究在蛋白質(zhì)分離純化中的應(yīng)用是包涵體的純化，大腸桿菌中重組蛋白的高表達(dá)常常導(dǎo)致無活性的包涵體的產(chǎn)生。雖然包涵體是無活性蛋白質(zhì)的聚沉物，但是它富含重組蛋白而且易于純化，能有效抵御宿主體內(nèi)蛋白酶的降解；此外，如果表達(dá)產(chǎn)物在天然狀態(tài)下對宿主細(xì)胞有毒性，使它以包涵體形式產(chǎn)生無疑可降低其毒性。因此包涵體的產(chǎn)生對蛋白質(zhì)的純化來說未必是一件壞事，但包涵體本身不是有生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)，要想得到有生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)，必須對包涵體進(jìn)行進(jìn)一步的處理。

編輯推薦

《普通高等教育"十一五"國家級規(guī)劃教材:基礎(chǔ)生物化學(xué)實驗(第3版)》適合高等院校及專科學(xué)校生物、農(nóng)、林、醫(yī)等專業(yè)使用。

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