生物化學實驗技術(shù)

前言

二十多年來，生命科學以驚人的速度突飛猛進地發(fā)展，許多新的邊緣學科、新的研究領(lǐng)域、新技術(shù)和新理論應運而生，深刻地影響著醫(yī)藥、環(huán)保、食品和工、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，以及人們?nèi)粘Ｉ畹闹T多方面，成為人類在新世紀科學發(fā)展的重要標志。作為一門基礎(chǔ)學科和帶頭學科，生物化學對生命科學的騰飛所作出的貢獻及其重要性有目共睹。因此，國家教育部及有關(guān)部委早在1997年就啟動了“面向21世紀高等農(nóng)林院校本科教育生物系列課程教學內(nèi)容和課程體制改革”，要求加強包括生物化學等基礎(chǔ)學科和帶頭學科的課程建設(shè)、教材建設(shè)和實驗室硬件建設(shè)。隨著國家對教育的投入不斷加大，高等教育的面貌日新月異，教育領(lǐng)域充滿生機。同時，學科的發(fā)展、社會對高素質(zhì)人才的要求，家長和學生對高等教育的期望，也在不斷提高，作為入圍國家“211”工程和“985”工程重點高校，我們深切地認識到與國內(nèi)外先進水平的差距和肩負責任的重大，正在急起直追，以期不負重托。我們一直比較重視實驗課教學，認為生物化學本來就是一門實驗性學科，實驗課不僅是整個教學工作重要的環(huán)節(jié)，而且在培養(yǎng)學生嚴謹務實的學科作風、協(xié)作共事的團隊精神、創(chuàng)造性思維以及分析和解決問題的能力等方面有著不可替代的作用。原有的教材已不能滿足新的需要，因而在已有教材的基礎(chǔ)上推出這部實驗教材，與面向21世紀課程教材《基礎(chǔ)生物化學》（第二版）配套使用。這本教材的內(nèi)容主要包括三部分：首先，重點介紹了常用生化實驗技術(shù)的基本原理，包括層析技術(shù)、電泳技術(shù)等。把實驗原理集中起來，一方面使這些涉及生物大分子分離、純化、檢查的常規(guī)技術(shù)系統(tǒng)化，有利于學生理解實驗操作，盡快掌握有關(guān)的基本技能；另一方面也可避免不必要的重復。第二部分設(shè)置了32個普通生化實驗。適合于對生物學相關(guān)專業(yè)學生進行基本的生化實驗技能訓練，以便增加學生的感性認識，與理論課教學相輔相成。第三部分安排了4個綜合性大實驗，這是本書的特色和本科生實驗教學的重要突破。通過這部分的實驗，不但可以把前面的有關(guān)知識和技能系統(tǒng)化、集成化，而且更貼近現(xiàn)代生化科研實踐，對于學生進一步學習其他相關(guān)課程或從事科研有直接的幫助和更為久遠的影響。本書適合于生物技術(shù)、生物科學、生物工程等專業(yè)學生使用，也可以選取其中部分內(nèi)容用于其他專業(yè)。本教材的編寫首先得益于多年來兄弟院校同行的大力支持，華中農(nóng)業(yè)大學洪玉枝老師、四川農(nóng)業(yè)大學陳惠老師、新疆農(nóng)業(yè)大學羅淑萍老師、山東農(nóng)業(yè)大學王憲澤老師、寧夏大學張慧茹老師等為我們提供了所在院校的實驗教學資料。

內(nèi)容概要

本書是普通高等教育“十一五”國家級規(guī)劃教材，是編者在多年生物化學實驗教學基礎(chǔ)上，為生物類及農(nóng)科各專業(yè)本科生生物化學實驗課編寫的教材。教材理論部分介紹了離心技術(shù)、層析技術(shù)、電泳技術(shù)及生物大分子制備技術(shù)。實驗部分包括生物化學基本實驗和生物化學綜合性實驗兩大部分?；緦嶒炦m用于生物類和農(nóng)科各專業(yè)生物化學實驗的基本訓練；綜合性實驗可用于生物技術(shù)等專業(yè)進行科研模擬訓練，也可用于研究生“生物化學研究技術(shù)”課程。書末附錄包括了生物化學常規(guī)儀器設(shè)備操作注意事項、常用試劑、溶液配制及常用數(shù)據(jù)列表等內(nèi)容。    本書內(nèi)容全面，實用性強，重視設(shè)計性和綜合性實驗，兼具廣度和深度，主要作為高等農(nóng)林院校本科生教材，也可供綜合性大學、師范院校本科生使用，還可作為相關(guān)教學和研究人員的參考書。

書籍目錄

第一部分 理論部分　1.1 離心技術(shù)　　1.1.1 離心沉降速率影響因素　　1.1.2 沉降系數(shù)　　1.1.3 離心設(shè)備　　1.1.4 制備超離心法　　1.1.5 離心操作的注意事項　　參考文獻　1.2 層析技術(shù)　　1.2.1 層析的基本概念　　1.2.2 層析的基本理論　　1.2.3 層析法的分類　　1.2.4 柱層析的基本裝置及操作　　1.2.5 常用的層析方法　　參考文獻　1.3 電泳技術(shù)　　1.3.1 電泳的基本原理　　1.3.2 影響電泳的主要因素　　1.3.3 電泳的分類　　1.3.4 電泳系統(tǒng)　　1.3.5 醋酸纖維素薄膜電泳　　1.3.6 聚丙烯酰胺凝膠電泳　　1.3.7 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳　　1.3.8 連續(xù)梯度電泳　　1.3.9 等電點聚焦電泳　　1.3.10 雙向電泳　　1.3.11 瓊脂糖凝膠電泳　　1.3.12 毛細管電泳　　參考文獻　1.4 生物大分子的制備　　1.4.1 生物大分子制備的前處理　　1.4.2 生物大分子的分離純化　　參考文獻第二部分 基本實驗　2.1 基礎(chǔ)訓練　　2.1.1 生物化學實驗要求　　2.1.2 生物樣品的采取、處理與保存　　2.1.3 高等植物材料丙酮粉的制備　　2.1.4 緩沖溶液的配制和氨基酸兩性性質(zhì)測定　　參考文獻　2.2 蛋白質(zhì)和氨基酸實驗　　2.2.1 蛋白質(zhì)的兩性性質(zhì)及等電點的測定　　2.2.2 氨基酸的薄層層析　　2.2.3 考馬斯亮藍G-250法測定蛋白質(zhì)含量　　2.2.4 紫外吸收法測定蛋白質(zhì)含量　　2.2.5 雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量　　2.2.6 Folin-酚法測定蛋白質(zhì)含量　　2.2.7 蛋白質(zhì)的沉淀與變性反應　　2.2.8 蛋白質(zhì)脫鹽（透析和凝膠過濾）　　2.2.9 用DNS法鑒定蛋白質(zhì)或多肽的N端氨基酸　　2.2.10 等電點聚焦電泳法測定蛋白質(zhì)的等電點　　參考文獻　2.3 酶學實驗　　2.3.1 酶的基本性質(zhì)　　2.3.2 過氧化氫酶活力的測定　　2.3.3 脲酶（urease）Km值簡易測定法　　2.3.4 淀粉酶活力測定　　2.3.5 轉(zhuǎn)氨酶活性鑒定（紙層析法）　　2.3.6 植物苯丙氨酸解氨酶（PAL）的提取及活性測定　　2.3.7 同工酶聚丙烯酰胺凝膠電泳　　參考文獻　2.4 分子生物學基礎(chǔ)實驗　　2.4.1 質(zhì)粒DNA的提取及瓊脂糖凝膠電泳檢測　　2.4.2 聚合酶鏈反應（PCR）技術(shù)體外擴增DNA　　2.4.3 大腸桿菌感受態(tài)的制備和轉(zhuǎn)化實驗　　2.4.4 PCR產(chǎn)物的T-A克隆及重組子的藍白斑篩選　　2.4.5 植物基因組DNA提取、酶切及電泳分析　　參考文獻　2.5 糖、脂、維生素實驗　　2.5.1 蒽酮比色法測定植物組織中總糖和可溶性糖的含量　　2.5.2 還原糖含量測定——砷鉬酸比色法　　2.5.3 糖的薄層層析　　2.5.4 維生素A的含量測定　　2.5.5 維生素C含量測定——2，6-二氯酚靛酚法　　2.5.6 粗脂肪含量的測定——索氏抽提法　　參考文獻第三部分 綜合性實驗　3.1 酵母蔗糖酶的提取及其性質(zhì)的研究　　3.1.1 蔗糖酶的提取與部分純化　　3.1.2 離子交換柱層析純化蔗糖酶　　3.1.3 蔗糖酶各級分活性及蛋白質(zhì)含量的測定　　3.1.4 分離產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳檢測　　3.1.5 反應時間對產(chǎn)物濃度的影響　　3.1.6 pH對蔗糖酶活性的影響　　3.1.7 溫度對蔗糖酶活性的影響和反應活化能的測定　　3.1.8 底物濃度對催化反應速度的影響及米氏常數(shù)Km和最大反應速度Vmax的測定　　3.1.9 尿素（脲）抑制蔗糖酶的實驗　　參考文獻　3.2 溶菌酶的分離純化　　3.2.1 溶菌酶的粗提液的制備　　3.2.2 離子交換柱層析純化溶菌酶　　3.2.3 溶菌酶的透析與濃縮　　3.2.4 凝膠過濾層析純化溶菌酶　　3.2.5 溶菌酶的活性測定　　3.2.6 溶菌酶純度的鑒定　　參考文獻　3.3 豬血超氧化物歧化酶的分離純化、活性測定及同工酶鑒定　　3.3.1 豬血SOD的提取純化　　3.3.2 超氧化物歧化酶活性測定　　3.3.3 SOD同工酶鑒定　　參考文獻　3.4 種子蛋白質(zhì)系統(tǒng)分析　　3.4.1 種子蛋白質(zhì)含量測定（凱氏定氮法）　　3.4.2 種子蛋白質(zhì)氨基酸組分分析（氨基酸自動分析儀法）　　3.4.3 種子蛋白質(zhì)組分分析（連續(xù)累進提取法）　　3.4.4 種子蛋白質(zhì)亞基分析（SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法）　　參考文獻第四部分 附錄　一、實驗室安全及防護知識　二、各種儀器的使用注意事項　三、凝膠數(shù)據(jù)表　四、常用緩沖溶液的配制方法　五、硫酸銨飽和度的常用表　六、離心力與離心機轉(zhuǎn)速測算表

章節(jié)摘錄

版權(quán)頁：插圖：1.2.5.2 離子交換層析離子交換層析（ion exchange chromatography，IEC）是以離子交換劑為固定相，是目前生物化學領(lǐng)域中常用的一種層析方法，廣泛地應用于各種生化物質(zhì)如氨基酸、蛋白、糖類、核苷酸等的分離純化。離子交換層析是依據(jù)各種離子或離子化合物與離子交換劑的結(jié)合力不同而進行分離純化的。離子交換層析的固定相是離子交換劑，它是由一類不溶于水的惰性高分子聚合物質(zhì)，通過一定的化學反應共價結(jié)合上某種電荷基團形成的。離子交換劑可以分為三部分：高分子聚合物基質(zhì)、官能團和交換離子。官能團與高分子聚合物共價結(jié)合，形成一個帶電的可進行離子交換的基團。交換離子是結(jié)合于電荷基團上的相反離子，它能與溶液中其他的離子發(fā)生可逆的交換反應。交換離子帶正電的離子交換劑能與帶正電的離子發(fā)生交換作用，稱為陽離子交換劑；交換離子帶負電的離子交換劑與帶負電的離子基團發(fā)生交換作用，稱為陰離子交換劑。在一定條件下，溶液中的某種離子基團可以把交換離子置換出來，并通過電荷基團結(jié)合到固定相上，而交換離子則進入流動相，這就是離子交換層析的基本交換反應。通過在不同條件下的多次交換反應，就可以對溶液中不同的離子基團進行分離?？捎糜陔x子交換層析的介質(zhì)材料很多，常用的是離子交換樹脂，這是人工合成的難溶于一般溶劑的高分子聚合物，可分為陽離子交換樹脂和陰離子交換樹脂兩類。帶有酸性可電離基團（如-SOH），稱為陽離子交換樹脂。帶有堿性可電離基團（如R，NOH），稱為陰離子交換樹脂。另外，把纖維素上少量羥基用弱電離基團取代制成的纖維素衍生物，在生化分離方面也較為常見。它具有松散的親水性網(wǎng)絡(luò)，有較大的表面積，對生物高分子有較好的通透性。由于羥基被取代的百分比較低，離子交換纖維素的電荷密度比樹脂低很多，所以洗脫條件溫和，回收率高。常見的陰離子交換纖維素有磺酸甲基（SM）纖維素、羧甲基（CM）纖維素等，陽離子交換纖維素有二乙基氨基乙基（DEAE）纖維素、三乙基氨基乙基（TEAE）纖維素等。根據(jù)離子交換層析原理設(shè)計的氨基酸自動分析儀是一種典型的生化分離工具。1.2.5.3 親和層析親和層析（affinitychroma to graphy）是利用生物分子間特異的親和力而進行分離的一種層析技術(shù)。生物分子間存在很多特異性的相互作用，如抗原一抗體、酶一底物或抑制劑、激素一受體等，它們之間都具有專一可逆性結(jié)合的特性，這種結(jié)合力就稱為親和力。親和層析的分離原理是將具有親和力的兩個分子中的一個固定在不溶性基質(zhì)上，利用分子間親和力的特異性和可逆性，對另一個分子進行分離純化。被固定在基質(zhì)上的分子稱為配體，配體和基質(zhì)是共價結(jié)合的，構(gòu)成親和層析的固定相，稱為親和吸附劑。

編輯推薦

《生物化學實驗技術(shù)》是普通高等教育“十一五”國家級規(guī)劃教材之一。

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