心血管腎臟生理學(xué)實驗技術(shù)方法及其進(jìn)展

前言

《生理學(xué)技術(shù)與方法》在20世紀(jì)80年代由科學(xué)出版社出版，該書的出版對推動生理科學(xué)的發(fā)展起了重要作用。時隔20多年，隨著生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)的發(fā)展，生理學(xué)與分子生物學(xué)、生物醫(yī)學(xué)工程的相互滲透，相關(guān)基因的表達(dá)和基因芯片技術(shù)的應(yīng)用，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞因子作用的認(rèn)識不斷深化，體內(nèi)新的活性物質(zhì)和離子通道不斷被發(fā)現(xiàn)，分子生物學(xué)的發(fā)展，使得人們從分子水平逐漸認(rèn)識某些生命現(xiàn)象和疾病的本質(zhì)，也使臨床對疾病的實驗室診斷發(fā)生了革命性的變化，推動了生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)的進(jìn)步。概念不斷更新，新理論、新觀點(diǎn)和新信息不斷涌現(xiàn)，生理學(xué)出現(xiàn)新的分支和生長點(diǎn)，豐富了生理學(xué)的內(nèi)容；生理學(xué)研究從整體、離體器官水平不斷向細(xì)胞水平和分子水平深入，每一項理論的重要進(jìn)展都與新技術(shù)、新方法的應(yīng)用密切相關(guān)，每項技術(shù)方法的創(chuàng)新都使我們對生理學(xué)相關(guān)理論的認(rèn)識向前邁進(jìn)。新技術(shù)、新方法和新儀器的應(yīng)用孕育了新的機(jī)遇，它們是指導(dǎo)科技工作者邁向成功的工具與武器。因此，有必要出版一本介紹生理科學(xué)近二十幾年來使用的實驗方法與技術(shù)。這些新的技術(shù)、方法都分散在不同的期刊和書籍中，許多研究生和讀者苦于尋找實驗技術(shù)與方法的書刊，尤其是近年來，眾多先進(jìn)的研究手段不斷問世與發(fā)展，如單細(xì)胞研究方法，膜片鉗技術(shù)在心肌細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞和腎小管髓袢升支粗段研究中的應(yīng)用，心肌細(xì)胞收縮力的測定，制備小鼠缺血模型的新方法等，學(xué)習(xí)和掌握這些技術(shù)與方法，對選擇合適的科研手段與科研設(shè)計有重要幫助。本書從分子、細(xì)胞、離體器官、整體動物等不同水平，主要撰寫了心血管、腎臟生理學(xué)實驗技術(shù)方法，介紹了作者自己的經(jīng)驗和技巧，并適當(dāng)?shù)仃U述了方法的理論基礎(chǔ)，有利于研究生和科學(xué)工作者應(yīng)用這些技術(shù)方法去證明自己的假設(shè)和研究設(shè)想?？萍紕?chuàng)新靠實驗來求證，生理學(xué)也可以說是一門實驗科學(xué)。通常給研究對象施加某種刺激，觀察其反應(yīng)，從反應(yīng)中推斷分析某器官或細(xì)胞的功能，并揭示其內(nèi)在的聯(lián)系。

內(nèi)容概要

本書從分子、細(xì)胞、離體器官、整體動物等不同水平，主要撰寫了心血管、腎臟生理學(xué)實驗技術(shù)方法，介紹了作者自己的經(jīng)驗和技巧，并適當(dāng)?shù)仃U述了方法的理論基礎(chǔ)，有利于研究生和科學(xué)工作者應(yīng)用這些技術(shù)方法去證明自己的假設(shè)和研究設(shè)想。

書籍目錄

上篇  心臟生理學(xué)實驗技術(shù)與方法  第一章  分子生物學(xué)和心肌細(xì)胞實驗技術(shù)    第1節(jié)  分子生物學(xué)技術(shù)在心血管研究中的應(yīng)用    第2節(jié)  分子生物學(xué)技術(shù)在離子通道研究中的應(yīng)用    第3節(jié)  電壓鉗制技術(shù)    第4節(jié)  膜片鉗制技術(shù)原理和方法    第5節(jié)  小鼠竇房結(jié)細(xì)胞的分離    第6節(jié)  新生大鼠心肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)    第7節(jié)  細(xì)胞低氧技術(shù)    第8節(jié)  細(xì)胞內(nèi)鈣的測定    第9節(jié)  心肌細(xì)胞收縮／舒張功能及胞內(nèi)鈣離子濃度的測定    第10節(jié)  心肌細(xì)胞模擬缺血／再灌注模型和同步收縮與鈣信號的記錄分析    第11節(jié)  一種實用方便的細(xì)胞內(nèi)灌流技術(shù)    第12節(jié)  心肌線粒體滲透轉(zhuǎn)換孔開放程度評價    第13節(jié)  心肌細(xì)胞凋亡檢測    第14節(jié)  心肌閏盤連接間隙的觀測方法  第二章  離體心臟、組織實驗技術(shù)或模型    第1節(jié)  離體心臟灌流方法    第2節(jié)  小鼠心臟心室動力學(xué)測定    第3節(jié)  離體心房不應(yīng)期電場刺激——一種研究心臟交感神經(jīng)突觸前受體功能的有效方法    第4節(jié)  離體心肌(乳頭肌)收縮力的測定    第5節(jié)  經(jīng)冠狀動脈灌注兔左心室楔形組織塊標(biāo)本的制備    第6節(jié)  1angendorff離體心臟灌流法    第7節(jié)  離體心臟泵功能的測量方法    第8節(jié)  小動物離體灌流心臟電信號記錄方法    第9節(jié)  電壓敏感性光標(biāo)測實驗技術(shù)及其在心臟電生理研究中的應(yīng)用  第三章  心臟的整體動物實驗或模型    第1節(jié)  犬頸部神經(jīng)、迷走一交感干分離技術(shù)與方法    第2節(jié)  鼠、兔和犬血流動力學(xué)的測定方法    第3節(jié)  心肌缺血方法、心肌缺血模型與梗死范圍的測定    第4節(jié)  心肌缺血／再灌注損傷動物模型的制備    第5節(jié)  小鼠心臟缺血模型制備的新方法(小鼠冠狀動脈結(jié)扎制備心肌梗死模型更為高效的新方法及其與經(jīng)典方法的比較)    第6節(jié)  心力衰竭模型的制備    第7節(jié)  心律失常模型的制備    第8節(jié)  缺血期高血糖大鼠模型制備的實驗方法    第9節(jié)  瘢痕染色法——測量心肌梗死面積    第10節(jié)  采集心肌缺血區(qū)局部靜脈血的方法——犬心大靜脈與右心房搭橋術(shù)    第11節(jié)  在體冠狀動脈定量急性缺血模型    第12節(jié)  在體心臟電一機(jī)械活動記錄方法    第13節(jié)  采集和記錄電生理信號的一些基本原理    第14節(jié)  應(yīng)用自制心導(dǎo)管電極研究在體心臟電活動中篇  血管生理學(xué)實驗技術(shù)與方法  第四章  血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞的實驗技術(shù)    第1節(jié)  主動脈與腦皮層微血管血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)    第2節(jié)  微血管內(nèi)皮細(xì)胞HsP70蛋白表達(dá)測定    第3節(jié)  血管內(nèi)皮細(xì)胞酶活性的測定    第4節(jié)  血漿和血管內(nèi)皮細(xì)胞cAMP和cGMP含量的測定    第5節(jié)  一氧化氮的檢測方法    第6節(jié)  血管平滑肌細(xì)胞的急性分離技術(shù)    第7節(jié)  血管平滑肌細(xì)胞大電導(dǎo)鈣激活鉀通道(BKca)電流的記錄    第8節(jié)  小鼠腦動脈血管平滑肌細(xì)胞的分離方法    第9節(jié)  雙光子及多光子激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)在心血管中的應(yīng)用    第10節(jié)  血管活性物質(zhì)檢測    第11節(jié)  血清和微血管sOD活性和MDA含量的測定  第五章  離體血管實驗技術(shù)    第1節(jié)  離體血管舒縮功能的測定    第2節(jié)  離體頸動脈竇壓力感受器活動的研究方法    第3節(jié)  急性缺氧性肺血管收縮實驗  第六章  血管的整體動物實驗或模型    第1節(jié)  高血壓動物模型    第2節(jié)  動脈粥樣硬化模型的制備    第3節(jié)  肺動脈高壓的動物模型    第4節(jié)  低壓低氧性大鼠肺動脈高壓模型的建立    第5節(jié)  大鼠尾動脈壓測量方法    第6節(jié)  腦血管血栓形成動物模型的制備    第7節(jié)  大鼠實驗性血栓模型的建立及其評價    第8節(jié)  一種新的體內(nèi)血栓形成的動物模型下篇  腎臟生理學(xué)實驗技術(shù)與方法  第七章  腎臟的分子生物學(xué)和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)    第1節(jié)  腎組織蛋白的提取及westernB1ot印跡    第2節(jié)  常用腎臟細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)      一、腎小管上皮細(xì)胞      二、腎小球系膜細(xì)胞      三、腎小球內(nèi)皮細(xì)胞      四、注意事項    第3節(jié)  腎臟髓袢升支粗段鉀離子通道電流的觀察    第4節(jié)  腎臟的灌流與免疫組織化學(xué)實驗    第5節(jié)  水鈉平衡相關(guān)腦區(qū)的免疫組織化學(xué)實驗  第八章  腎臟的整體實驗及檢測    第1節(jié)  大鼠血壓記錄、尿液收集和腎排鈉功能測定    第2節(jié)  腦內(nèi)側(cè)腦室給藥的方法    第3節(jié)  腎小球濾過功能的檢查    第4節(jié)  腎小管功能的檢查    第5節(jié)  腎血漿流量的測定    第6節(jié)  腎臟內(nèi)分泌功能的檢查    第7節(jié)  腎動脈狹窄的超聲檢測  第九章  氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)檢測      一、丙二醛的測定——硫代巴比妥酸法      二、谷胱甘肽的測定      三、一氧化氮的測定——硝酸還原酶法      四、蛋白含量的測定——考馬斯亮藍(lán)蛋白測定試劑盒全書參考文獻(xiàn)

章節(jié)摘錄

插圖：（四）PCR技術(shù)的擴(kuò)展在生命科學(xué)中較常用的PCR技術(shù)擴(kuò)展有“巢式”PCR、復(fù)合PCR、不對稱PCR、反轉(zhuǎn)錄PCR、原位PCR、反向PCR、錨定PCR、修飾引物PCR等。原位PCR在心血管研究中則更為常用。PCR具有快速、靈敏、特異等優(yōu)點(diǎn)，但不能進(jìn)行組織細(xì)胞的定位，而原位雜交的敏感性較PCR低，其檢測范圍約為每個細(xì)胞中20-300個拷貝。原位PCR是原位雜交與PCR兩者的結(jié)合，因此具備兩種方法的優(yōu)點(diǎn)，即高度的敏感性、特異性與精確定位。其操作與原位雜交的區(qū)別在于，小的組織細(xì)胞切片制備好后，加入PCR緩沖液，在擴(kuò)增儀中擴(kuò)增5～10個循環(huán)，再進(jìn)行乙醇脫水、空氣干燥，結(jié)果檢測等。 三、核酸序列分析 核酸序列分析是分子生物學(xué)領(lǐng)域的一項基本技術(shù)，它對精確分析基因的結(jié)構(gòu)和功能十分重要。對DNA一級結(jié)構(gòu)的分析和研究，將有助于進(jìn)一步探索基因與疾病的關(guān)系，推動生命科學(xué)的深入發(fā)展。經(jīng)典的DNA核苷酸序列測定方法包括Sanger。雙脫氧核苷酸末端終止法和Maxam-Gilbert化學(xué)裂解法，以前者更為常用。這兩種方法都有賴于高分辨率變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，因變性聚丙烯酰胺凝膠電泳能分離長度達(dá)到300-500個堿基，而分辨相互問長度僅差一個堿基的單鏈寡聚核苷酸片段。雙脫氧核苷酸末端終止法是根據(jù)DNA復(fù)制的原理而設(shè)計的。它以單鏈或雙鏈DNA為模板與待測序列末端互補(bǔ)的寡核苷酸為引物，并以一種核素標(biāo)記的DNTP作為示蹤物，在4組鏈延伸反應(yīng)中分別加入4種不同的雙脫氧核苷三磷酸（DDNTP），因為DDNTP。沒有3-OH，不能與其他核苷酸形成3，5一磷酸二酯鍵，使新鏈的合成隨機(jī)終止于本應(yīng)摻人相應(yīng)DNT[，的位置上，從而得到終止于特定堿基的不同長度的寡聚核苷酸產(chǎn)物，而后將4組長度不等的單鏈DNA片段混合物經(jīng)聚丙烯酰胺電泳分離及放射自顯影，讀出核苷酸序列，完成整個測序過程。Maxam-Gilbert化學(xué)裂解法的基本原理是：首先對待測DNA片段進(jìn)行單側(cè)末端放射性核素標(biāo)記，然后將標(biāo)記后的DNA片段分成4或5個反應(yīng)體系（G、G+A、T+C、C反應(yīng)體系），分別用不同的化學(xué)試劑處理，使DNA片段分別與某一種或某一類堿基處斷裂（硫酸二甲酯可使鳥嘌呤甲基化；甲酸可使嘌呤環(huán)糖苷鍵減弱從而吡啶取代嘌呤環(huán)；肼能裂解嘧啶環(huán)進(jìn)而使其脫落；肼在有一定濃度的NACL的條件下僅使胞嘧啶開環(huán)）。另外還要控制化學(xué)反應(yīng)的進(jìn)程，使每個DNA分子只在一個位置被裂解，且斷裂的位置隨機(jī)發(fā)生在DNA片段某種堿基中的任何一個。因此裂解產(chǎn)物的長度可以從數(shù)個核苷酸到接近待測DNA全長。各反應(yīng)體系的產(chǎn)物在變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，放射自顯影后得到互相錯落的梯形圖譜，從而可讀出DNA序列。以上兩種方法不適用于大規(guī)模DNA序列測定的需要，隨著計算機(jī)技術(shù)、儀器制造和分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，DNA序列自動測定技術(shù)以及自動測序儀也取得了長足的進(jìn)展。

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