漢英醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法

前言

隨著醫(yī)學(xué)生物學(xué)知識和技術(shù)的迅速成長和不斷更新，對于國內(nèi)的科研工作者及學(xué)生，他們均有了解當(dāng)今細(xì)胞和分子技術(shù)的需求。一天，在美國伊利諾伊州芝加哥大學(xué)工作的年輕科研專家鄭維，產(chǎn)生了編寫一本漢英文常用實(shí)驗(yàn)方法書籍的想法。中國科研者在了解這些方法的同時(shí)，亦可學(xué)習(xí)專業(yè)的英語單詞。然后，他成功地召集了一批在美國各自領(lǐng)域工作的年輕的專家級中國科研者，由他們組成的編委及編者來撰寫這本很好的專業(yè)書，幾乎囊括了所有基礎(chǔ)的細(xì)胞和分子學(xué)方法。鄭維在中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院（前湖南長沙的湖南醫(yī)科大學(xué)）獲得博士學(xué)位。懷著對分子和細(xì)胞生物學(xué)的濃厚興趣以及對科學(xué)的熱衷，他于2001年來到美國。起初，他在西北大學(xué)，后到芝加哥大學(xué)做博士后。這本書與其他書籍有兩點(diǎn)不同，第一，此書大多為在美國工作的中國博士后所撰寫，他們非常熟悉實(shí)驗(yàn)方法，編寫此書時(shí)他們結(jié)合了當(dāng)今的方法及切身體會(huì)和經(jīng)驗(yàn)，而不是單純地將·些英語課本翻譯成中文；第二，本書采用漢英文形式，研究者使用這本書的時(shí)候，能快捷地學(xué)習(xí)一些專業(yè)的英語術(shù)語。我堅(jiān)信，對于國內(nèi)的生物醫(yī)學(xué)研究者來說，鄭維及同仁們編寫的這本書將是一本非常有實(shí)用價(jià)值的工具書。

內(nèi)容概要

本書是一本介紹當(dāng)今國外常用醫(yī)學(xué)生物學(xué)，重點(diǎn)是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室方法的書籍。全書共分十五部分，六十余章。按照實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹⒃?、材料、操作方法及注意事?xiàng)的結(jié)構(gòu)模式介紹每一實(shí)驗(yàn)技術(shù)。包括質(zhì)粒部分，PCR技術(shù)，常用的凝膠電泳，放射性探針的制備，DNA 及RNA部分，克隆基因在體外、原核細(xì)胞及哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)，病毒部分，蛋白質(zhì)檢測與分析，真核基因表達(dá)調(diào)控，組織學(xué)，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，細(xì)胞凋亡，轉(zhuǎn)基因、基因敲除鼠的構(gòu)建等常用方法；同時(shí)附有常用試劑和溶液及常用的生物學(xué)網(wǎng)站。采納的不僅有簡便、實(shí)用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，也有經(jīng)濟(jì)、高效的試劑盒方法。采用漢英對照，使讀者能更方便地理解英語的內(nèi)容。該書可供從事醫(yī)學(xué)及生物學(xué)領(lǐng)域研究的科研人員參考，特別適合準(zhǔn)備到國外深造和正在國外從事實(shí)驗(yàn)室研究者參考。

書籍目錄

1 質(zhì)粒1.1 用堿裂解并SDS法制備小量質(zhì)粒DNA1.2 聚乙二醇沉淀法純化質(zhì)粒DNA1.3 用QIAGEN質(zhì)粒大提試劑盒制備大量質(zhì)粒DNA1.4 用氯化鈣制備和轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受太細(xì)胞1.5 定向克隆到質(zhì)粒載體1.6 PCR產(chǎn)物克隆至T載體2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)2.1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外擴(kuò)增DNA2.2 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)2.3 實(shí)時(shí)定量PCR3 常用的凝膠電泳3.1 核酸凝膠電泳3.1.1 瓊脂糖凝膠電泳3.1.2 聚丙烯酰胺凝膠電泳3.2 蛋白質(zhì)凝膠電泳3.2.1 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳3.2.2 雙相電泳4 放射性探針的制備4.1 均一標(biāo)記DNA探針的合成4.2 RNA探針的合成4.3 CDNA探針的合成4.4 合成寡核苷酸的標(biāo)記5 DNA5.1 用QIAquick凝膠提取試劑盒從瓊脂糖凝膠中回收和純化DNA片段5.2 哺乳動(dòng)物細(xì)胞DNA的分離5.2.1 應(yīng)用蛋白酶K和苯酚從哺乳動(dòng)物細(xì)胞中分離高分子量的DNA5.2.2 鼠尾和其他小樣本基因組DNA的制備5.3 Southern雜交分析基因組DNA5.4 DNA的斑點(diǎn)與狹縫雜交5.5 微點(diǎn)陣技術(shù)5.6 DNA測序5.7 單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析5.8 變性的高效液相色譜5.9 DNA基因分型5.9.1 微衛(wèi)星基因分型5.9.2 PCR-RFLP SNP 基因分型5.9.3 焦磷酸測序SNP基因分型6. RNA6.1 用TRIzol試劑分離總RNA6.2 用Oligotexm RNA小提試劑盒從總RNA純化poly A+ mRNA6.3 Northern雜交6.4 eDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)7. 克隆基因在體外及原核細(xì)胞中的表達(dá)7.1 TNT快速轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)7.2 GST融合蛋白的純化7.3 GST吸附實(shí)驗(yàn)8. 克隆基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)8.1 哺乳動(dòng)物細(xì)胞的體外培養(yǎng)8.2 細(xì)胞周期分析8.3 DNA轉(zhuǎn)染8.3.1 磷酸鈣和DNA共沉淀的轉(zhuǎn)染8.3.2 陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染DNA8.3.3 DNA的電穿孔轉(zhuǎn)染8.4 應(yīng)用Gene Editor TM的DNA體外定點(diǎn)誘變系統(tǒng)9. 病毒9.1 快速產(chǎn)生重組腺病毒的簡便系統(tǒng)9.2 反轉(zhuǎn)錄病毒的產(chǎn)生10. 蛋白質(zhì)檢測與分析10.1 免疫沉淀法10.2 Western雜交10.3 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)11. 真核基因表達(dá)調(diào)控11.1 凝膠改變法11.2 熒光素酶法11.3 DNA甲基化分析11.4 核組蛋白免疫沉淀法(ChIP)11.5 RNA干擾(RNAi)12. 組織學(xué)12.1 組織切片的制備和H&E染色12.2 免疫組織化學(xué)13. 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)13.1 二維蛋白凝膠電泳——真核細(xì)胞樣品的制備13.1.1 從酵母制備2D蛋白提取物13.1.2 從哺乳動(dòng)物細(xì)胞制備分部去垢劑提取物13.2 色譜(層析法)13.3 為質(zhì)譜蛋白鑒定作凝膠內(nèi)酶切13.4 質(zhì)譜14. 細(xì)胞凋亡的檢測方法14.1 細(xì)胞群體凋亡的研究方法14.1.1 檢測DNA斷裂——凋亡DNA階梯14.1.2 凋亡誘導(dǎo)的蛋白酶-Caspase3活性檢測14.2 單個(gè)細(xì)胞凋亡的研究方法14.2.1 APO-BRDUTM試劑盒14.2.2 檢測細(xì)胞膜變化15. 轉(zhuǎn)基因和基因敲除小鼠的構(gòu)建15.1 應(yīng)用顯微注射法制備轉(zhuǎn)基因小鼠15.2 基因打靶小鼠的制備附錄1. 常用的試劑和溶液附錄2. 常用的生物學(xué)網(wǎng)站

章節(jié)摘錄

插圖：每一步的時(shí)間應(yīng)從反應(yīng)混合物達(dá)到所需要的溫度后開始計(jì)算。一般來說，由混合液原溫度達(dá)到所要求溫度的時(shí)間需要30～60秒。溫度滯后時(shí)間的長短取決于以下幾個(gè)因素，包括反應(yīng)管的類型、反應(yīng)混合物的體積、熱源（水浴或加熱塊）以及兩個(gè)連續(xù)步驟間的溫度差。因此調(diào)節(jié)溫育時(shí)間以補(bǔ)償這一滯后時(shí)間是非常重要的。兩寡核苷酸引物之間的距離越遠(yuǎn)，合成靶序列全長所需的時(shí)間也越長。上面給出的反應(yīng)時(shí)間是按1000個(gè)核苷酸的靶序列擬定的。（2）溫度：選擇寡核苷酸引物到DNA模板的退火溫度是一個(gè)折衷的方案。如果降低退火溫度則擴(kuò)增效率提高，但引物與模板間的錯(cuò)配現(xiàn)象又可明顯增加。若將溫度提高，則擴(kuò)增反應(yīng)的特異性增加，但總的反應(yīng)效率則會(huì)下降。因此理想的辦法是設(shè)置一系列對照反應(yīng)，以確定某一特定擴(kuò)增反應(yīng)的最適退火溫度。（3）循環(huán)次數(shù)：擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)數(shù)取決于反應(yīng)混合液中靶DNA的濃度，若將哺乳動(dòng)物基因組中單拷貝基因擴(kuò)增至能為瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳所見，至少需要25個(gè)循環(huán)。靶序列的指數(shù)式的擴(kuò)增不是一個(gè)無限制的過程。在正常反應(yīng)條件下，經(jīng)過25～30個(gè)循環(huán)擴(kuò)增后，Taq DNA聚合酶的酶量便成為制約反應(yīng)進(jìn)行的因素。如需進(jìn)一步擴(kuò)增，應(yīng)將所得的DNA樣品稀釋1000～10000倍后，再作為模板進(jìn)行新的PCR。（4）緩沖液：當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)緩沖液于72℃溫育時(shí)，反應(yīng)體系的pH值將下降1個(gè)多單位，致使緩沖液的pH值接近7.2。二價(jià)陽離子的存在至關(guān)緊要，鎂離子優(yōu)于錳離子，而鈣離子則無效。鎂離子的最佳作用濃度相當(dāng)?shù)停?.5mmol／L.），因此重要的是，所制備的模板DNA中不應(yīng)含有高濃度的螯合劑，如EDTA；也不應(yīng)含有高濃度的帶負(fù)電荷離子基團(tuán)，如磷酸根。

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《漢英醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法(第1版)》是由中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社出版的。

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