生物分子實(shí)驗(yàn)教材

內(nèi)容概要

為了適應(yīng)高等院校教育改革，新的四川大學(xué)建立了醫(yī)學(xué)生物分子實(shí)驗(yàn)室，并將原來免疫學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)課程納入這個實(shí)驗(yàn)室的教學(xué)范疇。這本教材就是在這個背景下產(chǎn)生的。
這本教材的內(nèi)容，除包括了原有的免疫學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)三門課程的主要實(shí)驗(yàn)外，還設(shè)計了一些綜合性實(shí)驗(yàn)，其目的不僅要讓學(xué)習(xí)者通過這樣的實(shí)驗(yàn)掌握較全面的實(shí)驗(yàn)技能，而且要使他們能夠?qū)⒏鲗W(xué)科的知識貫通起來綜合運(yùn)用。由于這樣的實(shí)驗(yàn)需要連續(xù)的操作，對學(xué)習(xí)者的意志、耐力、信心也將是一個考驗(yàn)。希望通過這樣的實(shí)驗(yàn)課學(xué)習(xí)，對學(xué)習(xí)者素質(zhì)的提高有所幫助。

書籍目錄

實(shí)驗(yàn)1  凝集反應(yīng)實(shí)驗(yàn)2  沉淀反應(yīng)實(shí)驗(yàn)3  免疫擴(kuò)散和免疫電泳實(shí)驗(yàn)4  補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)5  溶血實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)6  E玫瑰花環(huán)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)7  酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)8  豬脾(肝)細(xì)胞染色體工DNA的提取與測定實(shí)驗(yàn)9  植物染色體工DNA的提取實(shí)驗(yàn)10  細(xì)菌染色體DNA的提取實(shí)驗(yàn)11  酵母RNA的提取與測定實(shí)驗(yàn)12  定磷法測定核酸濃度實(shí)驗(yàn)13  質(zhì)粒DNA的提取實(shí)驗(yàn)14  隨機(jī)引物PCR測定細(xì)菌染色體DNA基因型實(shí)驗(yàn)15  核酸(DNA)電泳實(shí)驗(yàn)16  DNA的限制性核酸內(nèi)切酶酶切分析實(shí)驗(yàn)17  DNA的瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)18  從凝膠中回收目的DNA片段實(shí)驗(yàn)19  質(zhì)粒DNA與目的DNA片段的連接實(shí)驗(yàn)20  重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化原核細(xì)胞實(shí)驗(yàn)21  大腸埃希氏菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)22  重組克隆篩選實(shí)驗(yàn)23  蛋白質(zhì)的沉淀和變性反應(yīng)實(shí)驗(yàn)24  血清蛋白乙酸纖維素膜電泳實(shí)驗(yàn)25  瓊脂糖凝膠電泳分離脂蛋白實(shí)驗(yàn)26  聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白實(shí)驗(yàn)27  染色法測定蛋白質(zhì)濃度實(shí)驗(yàn)28  Folin一酚法測定蛋白質(zhì)濃度實(shí)驗(yàn)29  紫外吸收法測定蛋白質(zhì)濃度實(shí)驗(yàn)30  SDS—PAGE測定蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量實(shí)驗(yàn)31  超氧化物歧化酶的分離和純化實(shí)驗(yàn)32  超氧化物歧化酶活性染色鑒定法實(shí)驗(yàn)33  血清高密度脂蛋白一膽固醇和總膽固醇的測定實(shí)驗(yàn)34  去污劑及膜活性試劑對紅細(xì)胞細(xì)胞膜的作用實(shí)驗(yàn)35  滴定法測定維生素C的含量實(shí)驗(yàn)36  細(xì)胞色素C的制備實(shí)驗(yàn)37  細(xì)胞色素C含鐵量的測定實(shí)驗(yàn)38  堿性磷酸酶的分離、純化和動力學(xué)實(shí)驗(yàn)39  肝糖原的提取與鑒定實(shí)驗(yàn)40  尿糖定性實(shí)驗(yàn)專題介紹單克隆抗體制備技術(shù)酶免疫組化染色技術(shù)熒光免疫組化技術(shù)DNA序列分析

章節(jié)摘錄

書摘                                 質(zhì)粒DNA的提取                                                         【原理】    質(zhì)粒DNA是細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立存在的分子，為雙鏈環(huán)狀DNA，無蛋白質(zhì)，主要存在于原核細(xì)胞和植物細(xì)胞。質(zhì)粒DNA在細(xì)胞內(nèi)游離于染色體外，不與染色體DNA發(fā)生整合，并以多拷貝形式存在。由于質(zhì)粒DNA能在細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立復(fù)制，不依賴細(xì)胞分裂和染色體的控制，所以在分子生物學(xué)中被廣泛利用來作為攜帶外源DNA的載體，即利用分子克隆技術(shù)把外源DNA片段或基因重組到質(zhì)粒DNA分子上，然后通過轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，獲得帶有外源基因或DNA片段的克隆(無性繁殖系)?？恐拗骷?xì)胞的快速繁殖和質(zhì)粒本身在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制，可以獲得大量拷貝的克隆的外源基因或DN．A片段，還可以使外源基因在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)出蛋白質(zhì)。因此，根據(jù)質(zhì)粒作為DNA載體的兩個目的，可以將質(zhì)粒載體分為兩類：一是單純用來克隆和擴(kuò)增外源DNA片段或基因的質(zhì)粒DNA分子，稱之為克隆載體(克隆質(zhì)粒)；另一類是在克隆載體的基礎(chǔ)上，在質(zhì)粒DNA分子多克隆位點(diǎn)上游的適當(dāng)位置裝有蛋白質(zhì)表達(dá)調(diào)控元件(一般是啟動子結(jié)構(gòu))的質(zhì)粒，稱之為表達(dá)載體(表達(dá)質(zhì)粒)。根據(jù)表達(dá)調(diào)控元件的性質(zhì)(真核或原核)，表達(dá)質(zhì)粒又進(jìn)一步分為真核表達(dá)質(zhì)?；蛟吮磉_(dá)質(zhì)粒。    作為載體分子，在克隆中所用的質(zhì)粒應(yīng)當(dāng)具有幾個必要的條件：    (1)必須具有能在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的復(fù)制起點(diǎn)，才能在宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行自主復(fù)制；    (2)必須具有可以與外源DNA連接的多種限制性核酸內(nèi)切酶的單一的酶切位點(diǎn)，這樣才能使外源DNA與載體分子被完成切割和連接，形成重組的質(zhì)粒DNA分子；    (3)載體分子上應(yīng)當(dāng)具有可進(jìn)行篩選的標(biāo)記片段，如抗生素抗性基因、酶基因、營養(yǎng)缺陷基因等；    (4)質(zhì)粒載體的分子不應(yīng)過大，這樣才能連接一定大小的外源DNA片段。    對克隆載體的要求是能夠通過復(fù)制獲得大量的外源DNA拷貝，因此這種載體應(yīng)能在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞內(nèi)有更多的拷貝數(shù)；對表達(dá)載體來說，需要在多克隆插入位點(diǎn)的上游裝備與宿主細(xì)胞相適應(yīng)的啟動子、前導(dǎo)序列、加尾信號、增強(qiáng)子等。有的表達(dá)載體還加有信號肽基因或融合蛋白基因片段，以利于表達(dá)檢測或表達(dá)產(chǎn)物的提純。    質(zhì)粒DNA的提取是分子生物學(xué)的基本操作技術(shù)，是分子生物學(xué)技術(shù)的一個基礎(chǔ)。制備質(zhì)粒DNA分子有不同的目的。為了獲得純的質(zhì)粒DNA，以便進(jìn)行分子克隆、蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)物的提取和純化或者用來轉(zhuǎn)染供化細(xì)胞時，需要將帶有質(zhì)粒的細(xì)菌進(jìn)行大量培養(yǎng)，從中提取出較多的質(zhì)粒DNA備用。而小量提取質(zhì)粒DNA常常用在克隆的鑒定上，即在重組DNA分子轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染細(xì)胞以后，從轉(zhuǎn)化的平板或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞培養(yǎng)板上挑取幾個菌落或細(xì)胞克隆進(jìn)行鑒定。將菌落或細(xì)胞克隆按質(zhì)粒DNA提取方法提取，直接進(jìn)行電泳或經(jīng)過酶切來判斷是否帶有質(zhì)粒以及質(zhì)粒上是否有外源DNA分子插入。如有，證明重組成功；如無，則需再從更多的克隆提取質(zhì)粒DNA進(jìn)行鑒定。小量提取質(zhì)粒DNA分子具有快速、簡便的優(yōu)點(diǎn)。一般一個人一次可同時做多個克隆的鑒定。小量質(zhì)粒分子DNA的提取是初學(xué)者做分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的第一步。大量的分子生物學(xué)研究是圍繞著核酸分子展開的，掌握這項(xiàng)技術(shù)，對每一個從事分子生物學(xué)工作的人來說都是必需的。    【方法】    1．有質(zhì)粒的宿主菌的培養(yǎng)：用接種環(huán)在酒精燈火焰上燒紅滅菌并冷卻后，從細(xì)菌平板上挑取單個菌落，接種至裝有2ml～3ml LB培養(yǎng)基的中試管中，370(2搖床振搖培養(yǎng)12h；或者直接從保存的液體菌種中蘸取少量細(xì)菌，接種到中試管中，同樣3713振蕩培養(yǎng)12h；或者用接種環(huán)直接從培養(yǎng)的細(xì)菌平板上刮取單個克隆，接種到裝有1．5mlTE緩沖液的Eppendorf離心管中。    2．從過夜培養(yǎng)的細(xì)菌液中取1．5ml裝入Eppendorf離心管，用臺式離心機(jī)以12000r／min離心30s。如果是刮取的細(xì)菌克隆，則直接離心。    3．倒去上清液，將離心管倒放在實(shí)驗(yàn)桌面的衛(wèi)生紙上以控干離心管中．的培養(yǎng)液。    4．加入100IA溶液工，用漩渦振蕩器將沉淀充分懸浮，或用移液器吹吸的方式反復(fù)吹吸，使細(xì)菌沉淀充分懸浮。室溫放置5mino    5．加人200~1的溶液Ⅱ(臨時配制)，蓋緊管蓋后溫和顛倒離心管3～5次，使管內(nèi)液體充分混勻，冰浴5min。    6．加入150l的溶液Ⅲ，猛甩離心管2次，使管內(nèi)液體混勻，冰浴3mlno    7．以12000r／min離心5min(室溫或4℃)。    8．用移液器將上清液吸到另一Eppendorf離心管中，加入2倍體積的無水乙醇，上下顛倒離心管，使管內(nèi)液體混勻。以12000r／min離心10m．in(室溫)。    9．倒去上清液，將離心管倒放在桌面的衛(wèi)生紙上，盡量控干(約5min)。    10．加人15t-dIE緩沖液，在沉淀位置將沉淀溶解，以供電泳檢測。    酶聯(lián)免疫吸附測定(erlzylne—linked immunosorbent assay，ELISA)是在免疫酶技術(shù)(immunoenzymatic technique)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的免疫測定技術(shù)，現(xiàn)已經(jīng)成為臨床醫(yī)學(xué)的常規(guī)檢測技術(shù)，用于檢測抗體、抗原或半抗原。    ELISA的技術(shù)包括固相載體吸附抗體(抗原)  (又稱之為包被)，加入待測抗原(抗體)，再與相應(yīng)的酶標(biāo)記抗體(抗原)進(jìn)行抗原抗體的特異免疫反應(yīng)，生成抗體(抗原)—待測抗原(抗體)—酶標(biāo)記抗體(抗原)的復(fù)合物，最后與該酶的底物反應(yīng)生成有色產(chǎn)物。由于待測抗原(抗體)的量與生成的有色產(chǎn)物成正比，所以可借助光吸收率計算抗原(抗體)含量。    酶結(jié)合物是酶與抗體或抗原、半抗原在交聯(lián)劑作用下聯(lián)結(jié)的產(chǎn)物，它是ELISA成敗的關(guān)鍵試劑。ELISA不僅具有抗原抗體特異的免疫學(xué)反應(yīng)，還具有酶促反應(yīng)，因而顯示出生物放大作用。制備的酶結(jié)合物必須符合高純度、高活性、單價性三個條件。其中的酶應(yīng)具有性能穩(wěn)定、經(jīng)濟(jì)易得、單獨(dú)使用時對底物不產(chǎn)生顏色反應(yīng)、只有終產(chǎn)物顯色以及便于檢測等特點(diǎn)。常用的酶有堿性磷酸酯酶、辣根過氧化物酶(horseradperoxidase，ImP)、葡萄糖氧化酶、半乳糖苷酶等(表7—1)。它們均可催化相應(yīng)的無色底物產(chǎn)生有色產(chǎn)物，并有特定的光吸收峰，終止酶促反應(yīng)后，底物不再改變。    ……

媒體關(guān)注與評論

書評為了適應(yīng)高等院校教育改革，新的四川大學(xué)建立了醫(yī)學(xué)生物分子實(shí)驗(yàn)室，并將原來免疫學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)課程納入這個實(shí)驗(yàn)室的教學(xué)范疇。這本教材就是在這個背景下產(chǎn)生的。    這本教材的內(nèi)容，除包括了原有的免疫學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)三門課程的主要實(shí)驗(yàn)外，還設(shè)計了一些綜合性實(shí)驗(yàn)，其目的不僅要讓學(xué)習(xí)者通過這樣的實(shí)驗(yàn)掌握較全面的實(shí)驗(yàn)技能，而且要使他們能夠?qū)⒏鲗W(xué)科的知識貫通起來綜合運(yùn)用。由于這樣的實(shí)驗(yàn)需要連續(xù)的操作，對學(xué)習(xí)者的意志、耐力、信心也將是一個考驗(yàn)。希望通過這樣的實(shí)驗(yàn)課學(xué)習(xí)，對學(xué)習(xí)者素質(zhì)的提高有所幫助。    我國的教育體制與國外有所不同，但在培養(yǎng)學(xué)習(xí)者成才這個目的上應(yīng)當(dāng)是相同的。怎樣達(dá)到這個目的，對教育工作者來說是需要探索的。編寫這本教材，實(shí)際上就是要吸取前人的精華而彌補(bǔ)他們的不足。我們愿意盡力把這項(xiàng)工作做好。盡管愿望很好，但本教材仍可能存在新的問題。我們誠懇地虛心地歡迎使用者和前輩們、同行們提出寶貴的意見，以便我們今后修正，把大學(xué)的生物分子實(shí)驗(yàn)教學(xué)做得更好。    這本教材是為大學(xué)本科生編寫的，也適合作為研究生或教師的參考用書。  編者2004春季

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為了適應(yīng)高等院校教育改革，新的四川大學(xué)建立了醫(yī)學(xué)生物分子實(shí)驗(yàn)室，并將原來免疫學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)課程納入這個實(shí)驗(yàn)室的教學(xué)范疇。這本教材就是在這個背景下產(chǎn)生的。這本教材的內(nèi)容，除包括了原有的免疫學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)三門課程的主要實(shí)驗(yàn)外，還設(shè)計了一些綜合性實(shí)驗(yàn)，其目的不僅要讓學(xué)習(xí)者通過這樣的實(shí)驗(yàn)掌握較全面的實(shí)驗(yàn)技能，而且要使他們能夠?qū)⒏鲗W(xué)科的知識貫通起來綜合運(yùn)用。由于這樣的實(shí)驗(yàn)需要連續(xù)的操作，對學(xué)習(xí)者的意志、耐力、信心也將是一個考驗(yàn)。希望通過這樣的實(shí)驗(yàn)課學(xué)習(xí)，對學(xué)習(xí)者素質(zhì)的提高有所幫助。

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