流式細胞術(shù)操作規(guī)程

前言

自20世紀40年代以來，流式細胞術(shù)已經(jīng)發(fā)展成為一門涉及激光技術(shù)、流體動力學、電子學、光學、計算機科學、物理學、化學、生物學和數(shù)學多學科交融的科學技術(shù)。近年來，儀器的革新，小型低能量的激光器的發(fā)展，新的熒光素和熒光蛋白的發(fā)現(xiàn)，以及新的方法學的應(yīng)用都對高速發(fā)展的流式細胞術(shù)的應(yīng)用起了很大的促進作用。在流式細胞術(shù)操作規(guī)程完全修訂和反映最新成果技術(shù)的第2版中，領(lǐng)銜的科學研究者們將那些已被時間證明的、前沿的關(guān)鍵性技術(shù)準確無誤地展示給我們。編者期望最新權(quán)威性的流式技術(shù)方法匯集的本書不僅能夠成為經(jīng)驗豐富流式細胞儀使用者的有價值的參考手冊，而且也能對生物學和生物醫(yī)學科學領(lǐng)域的新手們起到有效的指導作用。在流式細胞儀介紹一章中，作者從流式細胞術(shù)歷史開始到對該技術(shù)將來的展望結(jié)束，為我們概括地描述了流式細胞術(shù)全貌和各種不同的應(yīng)用。第2至22章包括了實用性很強的詳細的操作程序和最新的技術(shù)。實驗設(shè)計的詳細介紹，實用的設(shè)計技巧，試劑和數(shù)據(jù)分析工具的選擇使得研究者不僅能夠?qū)⒘魇郊夹g(shù)應(yīng)用于傳統(tǒng)的表型特征分析，而且完全能應(yīng)用于新出現(xiàn)的基因組學和蛋白組學的研究。為了使操作規(guī)程更加完善，作為補充，本書在第23和24章中前瞻性地介紹了應(yīng)用未來一代的固體激光在高速分選中防止感染性氣溶膠形成的快速方法。在本書中介紹了一種最新的基于顏色的細胞設(shè)門策略，該策略使復雜的多參數(shù)資料的分析變得更加簡單明了。流式細胞儀復雜的多參數(shù)描述最好地證明了在以功能為基礎(chǔ)的分子機制的研究可以在單細胞水平進行。這是采用高度特異性抗體，通過鑒別磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白來測定細胞內(nèi)激酶信號級聯(lián)反應(yīng)的完美展示；結(jié)合免疫表型分型，可以解釋在異質(zhì)性群體中個體細胞獨立的生物化學信號事件。其他的操作規(guī)程是有關(guān)T細胞亞群特征分析的如：細胞內(nèi)細胞因子染色可以應(yīng)用于對罕見的抗原特異性T細胞的定量；四聚體細胞示蹤染料可以和細胞因子染色技術(shù)相結(jié)合，確定抗原特異性細胞前體細胞的增殖頻數(shù)；抗原特異性細胞毒性T細胞的細胞溶解功能，也可以通過采用非核素標記的方法，測定包括不同譜系來源的原代細胞在內(nèi)的靶細胞內(nèi)的半胱天冬酶的活化。同時，也闡述了分析凋亡的多種方法，如同時分析半胱天冬酶活化、annexin V結(jié)合膜磷脂酰絲氨酸殘基以及DNA染料穿膜對DNA染色等方法。我們在本書中向試圖涉獵干細胞領(lǐng)域的研究者推薦一些檢測干細胞備選的方法。有兩種方法可以檢測造血干細胞向胞外釋放活細胞染料Hoechst 33342和羅丹明123的能力。由于這些方法避免了確認細胞表面抗原，因此，被廣泛地應(yīng)用于缺乏確定的細胞表面抗原的其他類型的干細胞。第三種方法可以用來研究人造血干細胞表面CD34抗原的生物學作用。原代細胞如造血干細胞十分容易轉(zhuǎn)導外源性基因，因而便于進行細胞研究。來源于水母的綠色熒光蛋白（GFP）和來源于珊瑚蟲的GFP的類似物是這類研究常用的標記物。與其他的生物發(fā)光標記物不同的是，GFP和GFP相關(guān)蛋白發(fā)生熒光時不需要外源性底物或者協(xié)同因子。此外，本書還介紹了一些同時檢測多種熒光蛋白質(zhì)的方法。采用熒光激活細胞分選儀（FACS）分離細胞是一種非常有效的分離技術(shù)。FACS采用微陣列技術(shù)將有助于加速對復雜組織和器官中不同類別細胞基因表達的分析。對于這些技術(shù)的最新進展，我們在微陣列和雜交技術(shù)一章節(jié)中做詳細的討論，當然，其中也包括一些檢測活細胞內(nèi)生物分子間相互作用的創(chuàng)新性方法。熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）技術(shù)是利用GFP的二種光譜變量來確定蛋白質(zhì)相關(guān)的分子。將相關(guān)的蛋白與GFP構(gòu)成融合蛋白，使以前因抗體限制而不能采用FRET檢測的蛋白也能采用FRET檢測，同時發(fā)明了兩種利用FACS高通量特點研究新蛋白間相互作用的方法。第一個方法是哺乳動物的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)交互作用圈套（MAPPIT）技術(shù)，這是用來篩選復雜cDNA文庫中新蛋白間相互作用的一種雙雜交檢測方法；第二個方法是采用流式細胞術(shù)快速從酵母菌表面展示文庫分離特異性抗原克隆。通過展示酵母菌表面的單鏈抗體（scFv），不需要通過亞克隆、表達和scFv純化即可進行克隆的親和力篩選，且可以通過FACS快速分選出親和力最高的克隆。在其他的章節(jié)中，從事基礎(chǔ)和臨床的科研工作者會看到一些用于細胞周期非同步群體分析，確定DNA倍體、RNA含量和腫瘤細胞增殖狀態(tài)的方法。書中還介紹了以FRET為基礎(chǔ)的測定HIV-1病毒顆粒與初始T細胞融合的方法，這是一種原位的流式細胞染色體雜交檢測技術(shù)（flow-FISH），可用于檢測細胞老化和惡性化過程中端粒長度的改變，是較復雜的末端限制性片段Southern雜交方法的改良方法。這種方法還適合于研究其他病毒胞膜蛋白介導的病毒與細胞的融合。對于有興趣研究微生物的科研工作者，本書介紹了用于微生物研究的敏感的流式細胞改良檢測技術(shù)和微生物特異性檢測方法學的進展。在細菌多參數(shù)流式細胞術(shù)分析一章中，介紹了采用流式細胞術(shù)檢測生理狀態(tài)下革蘭陽性和革蘭陰性菌的可靠方法。實現(xiàn)了期待已久的多參數(shù)微生物的分析。我們非常感謝John Walker邀請我們參與這項令人興奮的工作，同時十分感謝他提供了專業(yè)的編輯幫助。感謝所有編者的真情投入，他們自愿分享各自最新研究結(jié)果的合作精神感染著整個流式細胞術(shù)學術(shù)界。

內(nèi)容概要

　　《流式細胞術(shù)操作規(guī)范》是國際上針對流式細胞術(shù)操作的權(quán)威著作，是應(yīng)用流式細胞術(shù)進行科研和臨床診斷數(shù)十年經(jīng)驗的總結(jié)?！读魇郊毎g(shù)操作規(guī)范》分為24章，詳細闡述了流式細胞術(shù)每一項操作的材料、用品、方法、注意事項，并配有插圖近200幅，圖文并茂，內(nèi)容實用，適于應(yīng)用相關(guān)技術(shù)的科研和臨床人員閱讀參考。

作者簡介

作者：（美國）霍利（Teresa S.Hawley） （美國）霍利（Robert G.Hawley） 譯者：邵啟祥

書籍目錄

第1章流式細胞術(shù)介紹 1概述 2細胞（或粒子或事件） 3激發(fā)光 4應(yīng)用流體學：細胞通過激光束 5細胞信號 6從信號到數(shù)據(jù) 7從數(shù)據(jù)到報告 8分選 9結(jié)論 第2章細菌的多參數(shù)流式細胞分析 1概述 2材料 3方法 4注釋 第3章白細胞的多參數(shù)數(shù)據(jù)的采集和分析 1概述 2材料 3方法 4注釋 第4章激酶信號級聯(lián)放大的流式細胞分析 1概述 2材料 3方法 4注釋 第5章細胞因子的流式細胞術(shù)分析 1概述 2材料 3方法 4注釋 第6章利用細胞示蹤染料檢測抗原特異性T細胞前體增殖的頻數(shù) 1概述 2材料 3方法 4注釋 第7章采用流式細胞術(shù)評估淋巴細胞介導的細胞毒作用 1概述 2材料 3方法 4注釋 第8章采用流式和影像細胞術(shù)多參數(shù)分析細胞調(diào)亡 1概述 2材料 3方法 4注釋 第9章通過邊緣群細胞表型檢測和富集造血干細胞 1概述 2材料 3方法 4注釋 第10章Hoechst 33342和Rhodamine 123染色分析造血干細胞特征 1概述 2材料 3方法 4注釋 第11章外周造血池動員的CD34NEG造血前體細胞表型和功能分析 1概述 2材料 3方法 4注釋 第12章熒光報告蛋白的多參數(shù)流式細胞術(shù) 1概述 2材料 3方法 4注釋 第13章熒光蛋白表達細胞的流式細胞術(shù)分析 1概述 2材料 3方法 4注釋 第14章聯(lián)合應(yīng)用流式細胞術(shù)和基因芯片方法檢測轉(zhuǎn)錄譜 1概述 2材料 3方法 4注釋 第15章熒光共振能量轉(zhuǎn)移的流式細胞分析 1概述 2材料 3方法 4注釋 第16章以熒光激活細胞分選技術(shù)為基礎(chǔ)的哺乳動物蛋白—蛋白相互作用陷阱 系統(tǒng)的建立 1概述 2材料 3方法 4注釋 第17章流式細胞術(shù)篩查酵母菌表面展示文庫 1概述 2材料 3方法 4注釋 第18章基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移的HIV—1病毒的融合分析 1概述 2材料 3方法 4注釋 第19章非同步化細胞群體的細胞周期分析 1概述 2材料 3方法 4注釋 第20章實體瘤DNA含量分析 1概述 2材料 3方法 4注釋 第21章DNA和RNA的同步流式分析 1概述 2材料 3方法 4注釋

章節(jié)摘錄

版權(quán)頁：   插圖：   Hawley等曾經(jīng)描述了采用合適的載體和轉(zhuǎn)染方法應(yīng)用于哺乳動物細胞培養(yǎng)，并在進一步的工作證實可以用流式細胞術(shù)四色法區(qū)分表達CFP、GFP、YFP和DsRed的混合細胞群。此項研究中應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒的載體成功表達FP，該載體中FP編碼序列為受長末端重復（LTR）啟動子控制，一個可選標簽則在內(nèi)部的核糖體進人位點（IRES）控制之下。重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒由單嗜性無輔助包裝細胞系GP+E—86產(chǎn)生，并進一步從轉(zhuǎn)染細胞中獲得表達各種FPs的穩(wěn)定細胞系。 Hara等應(yīng)用標準轉(zhuǎn)基因方法，獲得了表達GFP的轉(zhuǎn)基因鼠。該GFP是受控鼠胰島素I啟動子，這種轉(zhuǎn)基因鼠胰臟的β細胞是強熒光的。分離的胰臟細胞也可以用重組腺病轉(zhuǎn)染獲得表達GFP的胰島β細胞。本實驗中，將分離的細胞培養(yǎng)2d后轉(zhuǎn)染病毒，使其表達GFP，再用胰蛋白酶—EDTA處理以獲得單細胞懸液。 人們已應(yīng)用類似的方法來轉(zhuǎn)染分離的細胞，可以使特定類型細胞表達FPs。例如，Keyoung等用含有重組基因的腺病毒轉(zhuǎn)染分離的人胎兒腦細胞，以來自nestin和muhashi 1基因的啟動子／增強子序列調(diào)控腺病毒內(nèi)的GFP表達。在這些不同的啟動子／增強子序列控制下，這些基因和GFP的表達可以定義胎腦腦室發(fā)育中的重疊區(qū)域。 另一種病毒轉(zhuǎn)染的方法—DNA轉(zhuǎn)染也被應(yīng)用到鑒定特殊的細胞類型中。Roy等描述了構(gòu)建脂質(zhì)體介導轉(zhuǎn)染分離的白質(zhì)細胞的方法，在該方法中利用2’，3’—環(huán)核苷酸3’—磷酸二酯酶基因的早期（P2）啟動子調(diào)節(jié)GFP表達。但該方法的一個可能不利因素是轉(zhuǎn)染后（6～7d）需要一段相當長的培養(yǎng)時間，才能觀察較多大量表達GFP的細胞。 對于高等植物，有很多方法可用來定義復雜混合物內(nèi)的細胞類型。根據(jù)有無葉綠素可以定義樹葉中的葉肉和表皮細胞，基于這個參數(shù)能夠分離和分選原生質(zhì)體。正如細胞核一樣，可以根據(jù)轉(zhuǎn)基因表達GFP用流式分選植物原生質(zhì)體。可以將含有編碼FP序列的基因構(gòu)建于特定的啟動子后，通過轉(zhuǎn)基因植物，在特定啟動子控制下實現(xiàn)FP特異性表達于特定的細胞中。此外，啟動子／增強子捕獲法可應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因植物中，使得其特定的細胞亞群高表達熒光蛋白（具體見http://www.arabidopsis.org/abrc/haseloff.htm）。根據(jù)特定類型細胞內(nèi)FPs的累積，用流式分選原生質(zhì)體和細胞核的研究尚在進行中。表14—1所示是近期發(fā)表的文章一些例子，作者應(yīng)用聯(lián)合標記FP和流式細胞術(shù)從復雜組織中分析和分選（有時）某一類型的細胞。 1.4 基因芯片分析基因表達 自發(fā)明之后，DNA芯片就作為能同時大量分析基因表達的最常用平臺（Affymetrix公司商業(yè)化的原位光刻合成技術(shù)制造的DNA芯片沒有納入本文中，因為它們的使用方法基本上已程序化）。在大多數(shù)實驗環(huán)境下，DNA基因芯片提供了衡量，聚集在人們感興趣的細胞或組織中的大量RNA分子表達豐度的方法，因此必須注意它們顯示基因表達過程中非常特殊的一個方面。

編輯推薦

《流式細胞術(shù)操作規(guī)程(第2版)》適于應(yīng)用相關(guān)技術(shù)的科研和臨床人員閱讀參考。

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