流式細(xì)胞術(shù)操作規(guī)程

前言

自20世紀(jì)40年代以來(lái)，流式細(xì)胞術(shù)已經(jīng)發(fā)展成為一門(mén)涉及激光技術(shù)、流體動(dòng)力學(xué)、電子學(xué)、光學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)、物理學(xué)、化學(xué)、生物學(xué)和數(shù)學(xué)多學(xué)科交融的科學(xué)技術(shù)。近年來(lái)，儀器的革新，小型低能量的激光器的發(fā)展，新的熒光素和熒光蛋白的發(fā)現(xiàn)，以及新的方法學(xué)的應(yīng)用都對(duì)高速發(fā)展的流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用起了很大的促進(jìn)作用。在流式細(xì)胞術(shù)操作規(guī)程完全修訂和反映最新成果技術(shù)的第2版中，領(lǐng)銜的科學(xué)研究者們將那些已被時(shí)間證明的、前沿的關(guān)鍵性技術(shù)準(zhǔn)確無(wú)誤地展示給我們。編者期望最新權(quán)威性的流式技術(shù)方法匯集的本書(shū)不僅能夠成為經(jīng)驗(yàn)豐富流式細(xì)胞儀使用者的有價(jià)值的參考手冊(cè)，而且也能對(duì)生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)科學(xué)領(lǐng)域的新手們起到有效的指導(dǎo)作用。在流式細(xì)胞儀介紹一章中，作者從流式細(xì)胞術(shù)歷史開(kāi)始到對(duì)該技術(shù)將來(lái)的展望結(jié)束，為我們概括地描述了流式細(xì)胞術(shù)全貌和各種不同的應(yīng)用。第2至22章包括了實(shí)用性很強(qiáng)的詳細(xì)的操作程序和最新的技術(shù)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的詳細(xì)介紹，實(shí)用的設(shè)計(jì)技巧，試劑和數(shù)據(jù)分析工具的選擇使得研究者不僅能夠?qū)⒘魇郊夹g(shù)應(yīng)用于傳統(tǒng)的表型特征分析，而且完全能應(yīng)用于新出現(xiàn)的基因組學(xué)和蛋白組學(xué)的研究。為了使操作規(guī)程更加完善，作為補(bǔ)充，本書(shū)在第23和24章中前瞻性地介紹了應(yīng)用未來(lái)一代的固體激光在高速分選中防止感染性氣溶膠形成的快速方法。在本書(shū)中介紹了一種最新的基于顏色的細(xì)胞設(shè)門(mén)策略，該策略使復(fù)雜的多參數(shù)資料的分析變得更加簡(jiǎn)單明了。流式細(xì)胞儀復(fù)雜的多參數(shù)描述最好地證明了在以功能為基礎(chǔ)的分子機(jī)制的研究可以在單細(xì)胞水平進(jìn)行。這是采用高度特異性抗體，通過(guò)鑒別磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白來(lái)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)激酶信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的完美展示；結(jié)合免疫表型分型，可以解釋在異質(zhì)性群體中個(gè)體細(xì)胞獨(dú)立的生物化學(xué)信號(hào)事件。其他的操作規(guī)程是有關(guān)T細(xì)胞亞群特征分析的如：細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色可以應(yīng)用于對(duì)罕見(jiàn)的抗原特異性T細(xì)胞的定量；四聚體細(xì)胞示蹤染料可以和細(xì)胞因子染色技術(shù)相結(jié)合，確定抗原特異性細(xì)胞前體細(xì)胞的增殖頻數(shù)；抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞的細(xì)胞溶解功能，也可以通過(guò)采用非核素標(biāo)記的方法，測(cè)定包括不同譜系來(lái)源的原代細(xì)胞在內(nèi)的靶細(xì)胞內(nèi)的半胱天冬酶的活化。同時(shí)，也闡述了分析凋亡的多種方法，如同時(shí)分析半胱天冬酶活化、annexin V結(jié)合膜磷脂酰絲氨酸殘基以及DNA染料穿膜對(duì)DNA染色等方法。我們?cè)诒緯?shū)中向試圖涉獵干細(xì)胞領(lǐng)域的研究者推薦一些檢測(cè)干細(xì)胞備選的方法。有兩種方法可以檢測(cè)造血干細(xì)胞向胞外釋放活細(xì)胞染料Hoechst 33342和羅丹明123的能力。由于這些方法避免了確認(rèn)細(xì)胞表面抗原，因此，被廣泛地應(yīng)用于缺乏確定的細(xì)胞表面抗原的其他類(lèi)型的干細(xì)胞。第三種方法可以用來(lái)研究人造血干細(xì)胞表面CD34抗原的生物學(xué)作用。原代細(xì)胞如造血干細(xì)胞十分容易轉(zhuǎn)導(dǎo)外源性基因，因而便于進(jìn)行細(xì)胞研究。來(lái)源于水母的綠色熒光蛋白（GFP）和來(lái)源于珊瑚蟲(chóng)的GFP的類(lèi)似物是這類(lèi)研究常用的標(biāo)記物。與其他的生物發(fā)光標(biāo)記物不同的是，GFP和GFP相關(guān)蛋白發(fā)生熒光時(shí)不需要外源性底物或者協(xié)同因子。此外，本書(shū)還介紹了一些同時(shí)檢測(cè)多種熒光蛋白質(zhì)的方法。采用熒光激活細(xì)胞分選儀（FACS）分離細(xì)胞是一種非常有效的分離技術(shù)。FACS采用微陣列技術(shù)將有助于加速對(duì)復(fù)雜組織和器官中不同類(lèi)別細(xì)胞基因表達(dá)的分析。對(duì)于這些技術(shù)的最新進(jìn)展，我們?cè)谖㈥嚵泻碗s交技術(shù)一章節(jié)中做詳細(xì)的討論，當(dāng)然，其中也包括一些檢測(cè)活細(xì)胞內(nèi)生物分子間相互作用的創(chuàng)新性方法。熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）技術(shù)是利用GFP的二種光譜變量來(lái)確定蛋白質(zhì)相關(guān)的分子。將相關(guān)的蛋白與GFP構(gòu)成融合蛋白，使以前因抗體限制而不能采用FRET檢測(cè)的蛋白也能采用FRET檢測(cè)，同時(shí)發(fā)明了兩種利用FACS高通量特點(diǎn)研究新蛋白間相互作用的方法。第一個(gè)方法是哺乳動(dòng)物的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)交互作用圈套（MAPPIT）技術(shù)，這是用來(lái)篩選復(fù)雜cDNA文庫(kù)中新蛋白間相互作用的一種雙雜交檢測(cè)方法；第二個(gè)方法是采用流式細(xì)胞術(shù)快速?gòu)慕湍妇砻嬲故疚膸?kù)分離特異性抗原克隆。通過(guò)展示酵母菌表面的單鏈抗體（scFv），不需要通過(guò)亞克隆、表達(dá)和scFv純化即可進(jìn)行克隆的親和力篩選，且可以通過(guò)FACS快速分選出親和力最高的克隆。在其他的章節(jié)中，從事基礎(chǔ)和臨床的科研工作者會(huì)看到一些用于細(xì)胞周期非同步群體分析，確定DNA倍體、RNA含量和腫瘤細(xì)胞增殖狀態(tài)的方法。書(shū)中還介紹了以FRET為基礎(chǔ)的測(cè)定HIV-1病毒顆粒與初始T細(xì)胞融合的方法，這是一種原位的流式細(xì)胞染色體雜交檢測(cè)技術(shù)（flow-FISH），可用于檢測(cè)細(xì)胞老化和惡性化過(guò)程中端粒長(zhǎng)度的改變，是較復(fù)雜的末端限制性片段Southern雜交方法的改良方法。這種方法還適合于研究其他病毒胞膜蛋白介導(dǎo)的病毒與細(xì)胞的融合。對(duì)于有興趣研究微生物的科研工作者，本書(shū)介紹了用于微生物研究的敏感的流式細(xì)胞改良檢測(cè)技術(shù)和微生物特異性檢測(cè)方法學(xué)的進(jìn)展。在細(xì)菌多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)分析一章中，介紹了采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)生理狀態(tài)下革蘭陽(yáng)性和革蘭陰性菌的可靠方法。實(shí)現(xiàn)了期待已久的多參數(shù)微生物的分析。我們非常感謝John Walker邀請(qǐng)我們參與這項(xiàng)令人興奮的工作，同時(shí)十分感謝他提供了專(zhuān)業(yè)的編輯幫助。感謝所有編者的真情投入，他們自愿分享各自最新研究結(jié)果的合作精神感染著整個(gè)流式細(xì)胞術(shù)學(xué)術(shù)界。

內(nèi)容概要

　　《流式細(xì)胞術(shù)操作規(guī)范》是國(guó)際上針對(duì)流式細(xì)胞術(shù)操作的權(quán)威著作，是應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行科研和臨床診斷數(shù)十年經(jīng)驗(yàn)的總結(jié)?！读魇郊?xì)胞術(shù)操作規(guī)范》分為24章，詳細(xì)闡述了流式細(xì)胞術(shù)每一項(xiàng)操作的材料、用品、方法、注意事項(xiàng)，并配有插圖近200幅，圖文并茂，內(nèi)容實(shí)用，適于應(yīng)用相關(guān)技術(shù)的科研和臨床人員閱讀參考。

作者簡(jiǎn)介

作者：（美國(guó)）霍利（Teresa S.Hawley） （美國(guó)）霍利（Robert G.Hawley） 譯者：邵啟祥

書(shū)籍目錄

第1章流式細(xì)胞術(shù)介紹 1概述 2細(xì)胞（或粒子或事件） 3激發(fā)光 4應(yīng)用流體學(xué)：細(xì)胞通過(guò)激光束 5細(xì)胞信號(hào) 6從信號(hào)到數(shù)據(jù) 7從數(shù)據(jù)到報(bào)告 8分選 9結(jié)論 第2章細(xì)菌的多參數(shù)流式細(xì)胞分析 1概述 2材料 3方法 4注釋 第3章白細(xì)胞的多參數(shù)數(shù)據(jù)的采集和分析 1概述 2材料 3方法 4注釋 第4章激酶信號(hào)級(jí)聯(lián)放大的流式細(xì)胞分析 1概述 2材料 3方法 4注釋 第5章細(xì)胞因子的流式細(xì)胞術(shù)分析 1概述 2材料 3方法 4注釋 第6章利用細(xì)胞示蹤染料檢測(cè)抗原特異性T細(xì)胞前體增殖的頻數(shù) 1概述 2材料 3方法 4注釋 第7章采用流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用 1概述 2材料 3方法 4注釋 第8章采用流式和影像細(xì)胞術(shù)多參數(shù)分析細(xì)胞調(diào)亡 1概述 2材料 3方法 4注釋 第9章通過(guò)邊緣群細(xì)胞表型檢測(cè)和富集造血干細(xì)胞 1概述 2材料 3方法 4注釋 第10章Hoechst 33342和Rhodamine 123染色分析造血干細(xì)胞特征 1概述 2材料 3方法 4注釋 第11章外周造血池動(dòng)員的CD34NEG造血前體細(xì)胞表型和功能分析 1概述 2材料 3方法 4注釋 第12章熒光報(bào)告蛋白的多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù) 1概述 2材料 3方法 4注釋 第13章熒光蛋白表達(dá)細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)分析 1概述 2材料 3方法 4注釋 第14章聯(lián)合應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)和基因芯片方法檢測(cè)轉(zhuǎn)錄譜 1概述 2材料 3方法 4注釋 第15章熒光共振能量轉(zhuǎn)移的流式細(xì)胞分析 1概述 2材料 3方法 4注釋 第16章以熒光激活細(xì)胞分選技術(shù)為基礎(chǔ)的哺乳動(dòng)物蛋白—蛋白相互作用陷阱 系統(tǒng)的建立 1概述 2材料 3方法 4注釋 第17章流式細(xì)胞術(shù)篩查酵母菌表面展示文庫(kù) 1概述 2材料 3方法 4注釋 第18章基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移的HIV—1病毒的融合分析 1概述 2材料 3方法 4注釋 第19章非同步化細(xì)胞群體的細(xì)胞周期分析 1概述 2材料 3方法 4注釋 第20章實(shí)體瘤DNA含量分析 1概述 2材料 3方法 4注釋 第21章DNA和RNA的同步流式分析 1概述 2材料 3方法 4注釋

章節(jié)摘錄

版權(quán)頁(yè)：   插圖：   Hawley等曾經(jīng)描述了采用合適的載體和轉(zhuǎn)染方法應(yīng)用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)，并在進(jìn)一步的工作證實(shí)可以用流式細(xì)胞術(shù)四色法區(qū)分表達(dá)CFP、GFP、YFP和DsRed的混合細(xì)胞群。此項(xiàng)研究中應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒的載體成功表達(dá)FP，該載體中FP編碼序列為受長(zhǎng)末端重復(fù)（LTR）啟動(dòng)子控制，一個(gè)可選標(biāo)簽則在內(nèi)部的核糖體進(jìn)人位點(diǎn)（IRES）控制之下。重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒由單嗜性無(wú)輔助包裝細(xì)胞系GP+E—86產(chǎn)生，并進(jìn)一步從轉(zhuǎn)染細(xì)胞中獲得表達(dá)各種FPs的穩(wěn)定細(xì)胞系。 Hara等應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因方法，獲得了表達(dá)GFP的轉(zhuǎn)基因鼠。該GFP是受控鼠胰島素I啟動(dòng)子，這種轉(zhuǎn)基因鼠胰臟的β細(xì)胞是強(qiáng)熒光的。分離的胰臟細(xì)胞也可以用重組腺病轉(zhuǎn)染獲得表達(dá)GFP的胰島β細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)中，將分離的細(xì)胞培養(yǎng)2d后轉(zhuǎn)染病毒，使其表達(dá)GFP，再用胰蛋白酶—EDTA處理以獲得單細(xì)胞懸液。 人們已應(yīng)用類(lèi)似的方法來(lái)轉(zhuǎn)染分離的細(xì)胞，可以使特定類(lèi)型細(xì)胞表達(dá)FPs。例如，Keyoung等用含有重組基因的腺病毒轉(zhuǎn)染分離的人胎兒腦細(xì)胞，以來(lái)自nestin和muhashi 1基因的啟動(dòng)子／增強(qiáng)子序列調(diào)控腺病毒內(nèi)的GFP表達(dá)。在這些不同的啟動(dòng)子／增強(qiáng)子序列控制下，這些基因和GFP的表達(dá)可以定義胎腦腦室發(fā)育中的重疊區(qū)域。 另一種病毒轉(zhuǎn)染的方法—DNA轉(zhuǎn)染也被應(yīng)用到鑒定特殊的細(xì)胞類(lèi)型中。Roy等描述了構(gòu)建脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染分離的白質(zhì)細(xì)胞的方法，在該方法中利用2’，3’—環(huán)核苷酸3’—磷酸二酯酶基因的早期（P2）啟動(dòng)子調(diào)節(jié)GFP表達(dá)。但該方法的一個(gè)可能不利因素是轉(zhuǎn)染后（6～7d）需要一段相當(dāng)長(zhǎng)的培養(yǎng)時(shí)間，才能觀(guān)察較多大量表達(dá)GFP的細(xì)胞。 對(duì)于高等植物，有很多方法可用來(lái)定義復(fù)雜混合物內(nèi)的細(xì)胞類(lèi)型。根據(jù)有無(wú)葉綠素可以定義樹(shù)葉中的葉肉和表皮細(xì)胞，基于這個(gè)參數(shù)能夠分離和分選原生質(zhì)體。正如細(xì)胞核一樣，可以根據(jù)轉(zhuǎn)基因表達(dá)GFP用流式分選植物原生質(zhì)體。可以將含有編碼FP序列的基因構(gòu)建于特定的啟動(dòng)子后，通過(guò)轉(zhuǎn)基因植物，在特定啟動(dòng)子控制下實(shí)現(xiàn)FP特異性表達(dá)于特定的細(xì)胞中。此外，啟動(dòng)子／增強(qiáng)子捕獲法可應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因植物中，使得其特定的細(xì)胞亞群高表達(dá)熒光蛋白（具體見(jiàn)http://www.arabidopsis.org/abrc/haseloff.htm）。根據(jù)特定類(lèi)型細(xì)胞內(nèi)FPs的累積，用流式分選原生質(zhì)體和細(xì)胞核的研究尚在進(jìn)行中。表14—1所示是近期發(fā)表的文章一些例子，作者應(yīng)用聯(lián)合標(biāo)記FP和流式細(xì)胞術(shù)從復(fù)雜組織中分析和分選（有時(shí)）某一類(lèi)型的細(xì)胞。 1.4 基因芯片分析基因表達(dá) 自發(fā)明之后，DNA芯片就作為能同時(shí)大量分析基因表達(dá)的最常用平臺(tái)（Affymetrix公司商業(yè)化的原位光刻合成技術(shù)制造的DNA芯片沒(méi)有納入本文中，因?yàn)樗鼈兊氖褂梅椒ɑ旧弦殉绦蚧?。在大多?shù)實(shí)驗(yàn)環(huán)境下，DNA基因芯片提供了衡量，聚集在人們感興趣的細(xì)胞或組織中的大量RNA分子表達(dá)豐度的方法，因此必須注意它們顯示基因表達(dá)過(guò)程中非常特殊的一個(gè)方面。

編輯推薦

《流式細(xì)胞術(shù)操作規(guī)程(第2版)》適于應(yīng)用相關(guān)技術(shù)的科研和臨床人員閱讀參考。

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