組織工程學(xué)實(shí)驗(yàn)教程

前言

　　《組織工程學(xué)實(shí)驗(yàn)教程》定位于培養(yǎng)組織工程學(xué)、生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)、生物科學(xué)與生物技術(shù)等專業(yè)五年制本科生，并為醫(yī)學(xué)類和醫(yī)學(xué)工程學(xué)類的碩士與博士研究生提供選修課程及研究生指導(dǎo)教師的參考書。本教程旨在為培養(yǎng)質(zhì)量更高、數(shù)量更多、知識(shí)更新的科學(xué)知識(shí)復(fù)合型學(xué)生服務(wù)，為將來占領(lǐng)國際組織工程制高點(diǎn)輸送人才?！　≡诳茖W(xué)知識(shí)爆炸的時(shí)代，根據(jù)信息技術(shù)與信息高速公路迅速發(fā)展時(shí)期的特點(diǎn)，培養(yǎng)創(chuàng)新型人才是落實(shí)科學(xué)發(fā)展觀的關(guān)鍵。如何激發(fā)學(xué)生頭腦創(chuàng)新靈感的火花，產(chǎn)生創(chuàng)新思維是創(chuàng)新工作的首要任務(wù)；如何將創(chuàng)新思維運(yùn)作的構(gòu)想經(jīng)過實(shí)驗(yàn)技術(shù)的協(xié)助使之付諸于實(shí)踐，產(chǎn)生創(chuàng)新物質(zhì)，轉(zhuǎn)變?yōu)榻?jīng)濟(jì)與社會(huì)效益并服務(wù)社會(huì)是當(dāng)前國家的需要，教學(xué)中努力做到這些是實(shí)現(xiàn)科學(xué)技術(shù)生產(chǎn)力的具體體現(xiàn)?！　〗M織工程學(xué)是一門邊緣學(xué)科，是國際科學(xué)最前沿的學(xué)科之一。其宗旨是制造人體組織與器官替代物，用以修復(fù)疾病創(chuàng)傷所致的器官缺損，以恢復(fù)其基本結(jié)構(gòu)與形態(tài)，恢復(fù)其正常生理功能，恢復(fù)勞動(dòng)能力，達(dá)到治療疾病的目的。組織工程學(xué)真正興起至今不足20年，我國的一批專家教授為中國組織工程學(xué)走向世界建立了豐碑，使我國與國際先進(jìn)水平的差距較小。由于近年來我國科學(xué)技術(shù)發(fā)展迅猛，組織工程的教學(xué)與研究工作日新月異，加之我國人口眾多，對器官移植需求的呼聲越來越高，成為組織工程器官再造的強(qiáng)大動(dòng)力，也成為我國組織工程學(xué)科發(fā)展的促進(jìn)劑和催化劑?！　”窘滩木帉懩哿酥袊t(yī)科大學(xué)組織工程學(xué)研究所、第二軍醫(yī)大學(xué)、清華大學(xué)、南通大學(xué)、遼寧醫(yī)學(xué)院和延邊大學(xué)等院校從事組織工程器官實(shí)驗(yàn)研究與教學(xué)工作的專業(yè)人員的心血與汗水，是集體智慧的結(jié)晶。全書包括基本實(shí)驗(yàn)、綜合性實(shí)驗(yàn)和創(chuàng)新設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)三類，共7章37節(jié)內(nèi)容，對相關(guān)的實(shí)驗(yàn)室組建、實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目做了介紹，還配備了相關(guān)實(shí)驗(yàn)所用的主要大型儀器設(shè)備照片及其功能的簡要描述，書末附中英文索引，以方便使用者參考?！　∮捎诮M織工程學(xué)涉及面廣、內(nèi)容博大精深、發(fā)展瞬息萬變，而且這是國內(nèi)第一本用于培養(yǎng)本科生的組織工程學(xué)實(shí)驗(yàn)教程，可能有不足之處請使用者不吝賜教，以便再版時(shí)更臻完善。

內(nèi)容概要

組織工程學(xué)是目前生命科學(xué)與工程學(xué)相結(jié)合的熱點(diǎn)學(xué)科。本書是《組織工程學(xué)教程》的配套用書，也是醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、工程學(xué)等相關(guān)專業(yè)掌握該學(xué)科的實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)用書。全書分7章，對相關(guān)的實(shí)驗(yàn)室組建、實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目和常用儀器設(shè)備做了介紹，實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目包括基本實(shí)驗(yàn)、綜合性實(shí)驗(yàn)和創(chuàng)新設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)三類，其中介紹種子細(xì)胞的培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化及鑒定，種子細(xì)胞實(shí)驗(yàn)技術(shù)及應(yīng)用，常用支架材料制備的實(shí)驗(yàn)共43項(xiàng),常用基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)14項(xiàng)，還有5類組織工程化器官的構(gòu)建方法，并配有相關(guān)實(shí)驗(yàn)所用的主要大型儀器設(shè)備照片及其功能的簡要描述，附有中英文索引。本書方便實(shí)用，可供組織工程學(xué)、生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)、生物科學(xué)與生物技術(shù)類專業(yè)的本科生使用，還可成為醫(yī)學(xué)類和工程學(xué)類碩士與博士研究生的選修課程教材及研究生指導(dǎo)教師的參考用書。

書籍目錄

第1章  組織工程實(shí)驗(yàn)室的組建
  第一節(jié)  細(xì)胞培養(yǎng)室的設(shè)計(jì)與分級
    一、細(xì)胞培養(yǎng)前的實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)
    二、潔凈室
  第二節(jié)  細(xì)胞培養(yǎng)室的規(guī)章  制度
第2章  種子細(xì)胞的培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化及鑒定實(shí)驗(yàn)
  第一節(jié)  體外組織細(xì)胞培養(yǎng)概述
    一、體外培養(yǎng)環(huán)境的建立及儀器設(shè)備
    二、體外培養(yǎng)的基本原理、生存條件與培養(yǎng)用液
    三、細(xì)胞培養(yǎng)基本操作技術(shù)
  第二節(jié)  組織工程種子細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定
    一、小鼠胚胎干細(xì)胞的分離培養(yǎng)
    二、大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)
    三、大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的換液、傳代及活力測定
    四、大鼠成骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定
    五、大鼠破骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定
    六、大鼠胰島細(xì)胞的分離、純化及鑒定
    七、大鼠脂肪干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定
    八、大鼠毛囊干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定
    九、大鼠神經(jīng)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定
    十、兔外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定
    十一、人胎盤來源的間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定
    十二、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定
    十三、人臍動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定
  第三節(jié)  組織工程種子細(xì)胞的誘導(dǎo)分化及鑒定
    一、大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞的，誘導(dǎo)分化及鑒定
    二、大鼠脂肪干細(xì)胞向成骨細(xì)胞的誘導(dǎo)分化及鑒定
    三、大鼠脂肪干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞的誘導(dǎo)分化及鑒定
    四、大鼠脂肪干細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞的誘導(dǎo)分化及鑒定
    五、大鼠脂肪干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化及鑒定
    六、兔脂肪干細(xì)胞向成軟骨細(xì)胞的誘導(dǎo)分化及鑒定
    七、兔心肌樣細(xì)胞的誘導(dǎo)和分化
第3章  組織工程種子細(xì)胞實(shí)驗(yàn)技術(shù)及應(yīng)用
  第一節(jié)  細(xì)胞的標(biāo)記與識(shí)別
    一、增強(qiáng)綠色熒光蛋白報(bào)告基因的轉(zhuǎn)染標(biāo)記  
    二、β-半乳糖苷酶基因轉(zhuǎn)染標(biāo)記
    三、用Hoechst 33342進(jìn)行細(xì)胞核染色
    四、用5溴-2脫氧尿苷標(biāo)記正在分裂的細(xì)胞  
    五、DAPI染色標(biāo)記示蹤技術(shù)
    六、AAV-EGFP轉(zhuǎn)染大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及轉(zhuǎn)染后的檢測
    七、pEGFP-Bmb2載體轉(zhuǎn)染大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的定位和表達(dá)
  第二節(jié)  細(xì)胞的基因改造與修飾
    一、基因插入技術(shù)
    二、基因敲除技術(shù)
    三、基因定點(diǎn)突變技術(shù)  
    四、RNA干擾技術(shù)
  第三節(jié)  細(xì)胞治療
    一、細(xì)胞治療的概念
    二、細(xì)胞治療的意義
    三、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對大鼠腦缺血的修復(fù)和治療
第4章  組織工程常用支架材料的制備
  第一節(jié)  天然組織工程支架的制備
    一、天然組織工程骨支架的制備
    二、天然組織工程神經(jīng)支架的制備
    三、天然組織工程血管支架的制備
    四、天然組織工程殼聚糖支架材料的制備
    五、天然組織工程絲素蛋白支架材料的制備及孔隙率測定
    六、一種多通道殼聚糖神經(jīng)組織工程支架的制備
    七、以編織法為基礎(chǔ)制備殼聚糖神經(jīng)修復(fù)導(dǎo)管
    八、豬小腸黏膜下層的制備及形態(tài)學(xué)檢測
  第二節(jié)  人工合成組織工程支架的制備
    一、可降解葡萄糖聚酯的合成
    二、相分離法制備具單一方向微管結(jié)構(gòu)的PHBHHX組織工程支架
第5章  組織工程化器官的構(gòu)建
  第一節(jié)  骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合珊瑚羥基磷灰石支架構(gòu)建組織工程骨
  第二節(jié)  骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合生物活性陶瓷構(gòu)建組織工程骨
  第三節(jié)  骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合脫細(xì)胞真皮基質(zhì)構(gòu)建組織工程皮膚
  第四節(jié)  內(nèi)皮祖細(xì)胞性組織工程化帶瓣靜脈的構(gòu)建
  第五節(jié)  組織工程心瓣膜的體外制備
第6章  組織工程常用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)
  第一節(jié)  石蠟切片及HE染色
  第二節(jié)  免疫組織化學(xué)染色
  第三節(jié)  SDS_聚丙烯酰胺凝膠電泳
  第四節(jié)  RTl_PCR
  第五節(jié)  應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR檢測細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄水平
  第六節(jié)  組織工程骨膜體內(nèi)植入技術(shù)
  第七節(jié)  硬組織切片技術(shù)在組織工程骨研究中的應(yīng)用
  第八節(jié)  骨脫細(xì)胞后的有機(jī)成分分析
  第九節(jié)  細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇
  第十節(jié)  質(zhì)粒DNA的提取純化、限制性酶切及電泳檢測
  第十一節(jié)  DNA的重組連接
  第十二節(jié)  感受態(tài)細(xì)胞的制備及質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化
  第十三節(jié)  真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染
  第十四節(jié)  真核表達(dá)載體pEGFP-Bmb2的構(gòu)建
第7章  組織工程常用儀器設(shè)備的使用
  第一節(jié)  超凈工作臺(tái)
  第二節(jié)  倒置顯微鏡
  第三節(jié)  CO2培養(yǎng)箱
  第四節(jié)  BIO-rad垂直電泳槽
  第五節(jié)  離心機(jī)
  第六節(jié)  冷凍切片與恒冷箱切片機(jī)
  第七節(jié)  生物反應(yīng)器
  第八節(jié)  激光共聚焦顯微鏡
附錄A  中英文詞匯及縮略語索引

章節(jié)摘錄

　　隨著培養(yǎng)的進(jìn)程，營養(yǎng)物被消耗，細(xì)胞的代謝產(chǎn)物越來越多，尤其是細(xì)胞呼吸反應(yīng)釋放出的CO2及其他代謝產(chǎn)物如乳酸和丙酮酸越來越多，培養(yǎng)液的pH越來越低，培養(yǎng)液的顏色越來越黃。這時(shí)就需要更換新的培養(yǎng)液以適應(yīng)細(xì)胞生長的需要。分裂增殖和生長發(fā)育是體外培養(yǎng)細(xì)胞的兩大生命特征。大多數(shù)類型的有機(jī)體細(xì)胞在培養(yǎng)過程中能始終保持有絲分裂的能力。培養(yǎng)中的細(xì)胞只要生長空間許可，就會(huì)發(fā)生分裂增殖。只有當(dāng)增殖生長至互相緊密接觸成片時(shí)，便發(fā)生所謂的“接觸性抑制”現(xiàn)象而停止增殖。無論是貼壁生長的細(xì)胞還是懸浮生長的細(xì)胞，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，細(xì)胞分裂繁殖，細(xì)胞密度增加達(dá)到飽和，一方面可能長滿培養(yǎng)空間，另一方面細(xì)胞之間互相接觸而發(fā)生接觸性抑制，生長速度逐漸減慢甚至停止。例如貼壁細(xì)胞的相互匯合，使整個(gè)瓶底逐漸被細(xì)胞覆蓋，細(xì)胞難以繼續(xù)生長繁殖，需要進(jìn)行分瓶培養(yǎng)，這種將原代細(xì)胞分散接種的過程稱為傳代。傳代培養(yǎng)的實(shí)質(zhì)就是分割后再一次培養(yǎng)。MTT比色法的原理是活細(xì)胞的線粒體脫氫酶能將染料MTT轉(zhuǎn)變?yōu)椴豢扇苄缘淖仙w粒，后者被酸性異丙醇或二甲基亞砜（DMSO）溶解后所呈現(xiàn)的色度（用A值表示）反映出生活細(xì)胞的代謝水平。死亡細(xì)胞則無此酶的活性?！　　緦?shí)驗(yàn)步驟】　　1.培養(yǎng)細(xì)胞的換液　?。?）吸去或者傾出舊培養(yǎng)液?！　。?）若進(jìn)行全量換液，可用平衡鹽溶液輕緩漂洗培養(yǎng)物1或2次，棄平衡鹽溶液。　?。?）加入培養(yǎng)液，加入的量與換液前的量相同?！　。?）放回原來的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。對于懸浮生長的細(xì)胞，換液時(shí)僅需要用吸管吸出部分培養(yǎng)液，然后補(bǔ)加相同量新鮮培養(yǎng)液，即可繼續(xù)培養(yǎng)，或用離心棄掉原培養(yǎng)液，再用新鮮培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)。 　　……

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