分子生物學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教程

前言

筆者到上海交大生命學(xué)院工作的時(shí)間是2000年。第二年春天，在院領(lǐng)導(dǎo)的安排下，首次為生命學(xué)院開(kāi)設(shè)了細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，到現(xiàn)在已經(jīng)過(guò)去了8年多的時(shí)間。學(xué)院開(kāi)設(shè)分子生物學(xué)技術(shù)綜合實(shí)驗(yàn)的時(shí)間是2003年秋，筆者毛遂自薦承擔(dān)起這個(gè)責(zé)任。至今，這兩門實(shí)驗(yàn)課都至少進(jìn)行了10個(gè)輪回，帶實(shí)驗(yàn)課的教師也先后換成了年輕人。兩個(gè)實(shí)驗(yàn)的講義雖然分別改寫了多次，但基本上仍然維持了原來(lái)的格局。時(shí)下，筆者以原有的兩個(gè)實(shí)驗(yàn)講義為基礎(chǔ)，對(duì)其中部分內(nèi)容做了修改和補(bǔ)充，將兩者合并在一起，正式出版，名為《分子生物學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教程》。有關(guān)細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)指南一類的書籍目前國(guó)內(nèi)已經(jīng)出了很多，其中不乏高水平的。那為什么還要再出一本呢？我想理由有三。第一，本書有自己的特色。分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)部分，以融合蛋白的表達(dá)和檢測(cè)作為主線，構(gòu)成一個(gè)內(nèi)容上緊密聯(lián)系的系列實(shí)驗(yàn)，前后連貫，不可割裂。細(xì)胞生物學(xué)部分，以四膜蟲(chóng)為主要實(shí)驗(yàn)材料，其他材料盡可能少用，這對(duì)教學(xué)資源有限、又在開(kāi)展細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的國(guó)內(nèi)院校來(lái)講可能有值得借鑒之處。第二，已有的書往往收錄的內(nèi)容比較多，帶有手冊(cè)的性質(zhì)，其中很多實(shí)驗(yàn)的條件要求高、耗材貴、需時(shí)長(zhǎng)，適合研究工作者作為參考，但并不適合作為本科生的實(shí)驗(yàn)來(lái)做。本書所收錄的內(nèi)容都是在我院已經(jīng)開(kāi)展很久（少數(shù)即將開(kāi)展）的實(shí)驗(yàn)，對(duì)那些實(shí)際上難以開(kāi)展的實(shí)驗(yàn)本書是不收錄的。也就是說(shuō)，本書是一個(gè)實(shí)實(shí)在在的實(shí)驗(yàn)操作指導(dǎo)，并非手冊(cè)。也正是因?yàn)槿绱?，它至少可以作為一本正式的?shí)驗(yàn)教材，代替原來(lái)的講義，供上海交大的學(xué)生使用。實(shí)際上也有這樣的需求，因?yàn)槊磕晟虾＝淮髢H做細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的學(xué)生就有近500人，如果加上選修分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的學(xué)生人數(shù)就更多。第三，也是最重要的一點(diǎn)，本書在實(shí)驗(yàn)內(nèi)容上有所創(chuàng)新。就以免疫印跡實(shí)驗(yàn)為例，在近年出版的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教材中這是必不可少的內(nèi)容。但給本科生開(kāi)設(shè)這樣的實(shí)驗(yàn)，且每個(gè)學(xué)生都要親自操作，談何容易！如果用商品化的抗體，無(wú)論檢測(cè)何種抗原，其運(yùn)轉(zhuǎn)費(fèi)用都非常高，對(duì)于教學(xué)資源匱乏的普通高校來(lái)說(shuō)很難承擔(dān)得起。本書介紹的免疫印跡實(shí)驗(yàn)是用自制血清抗體來(lái)做的，這就大幅度降低了實(shí)驗(yàn)的成本，保證它能夠順利而持久地開(kāi)展下去。也正是因?yàn)橛玫氖亲灾蒲蹇贵w，特異性不高，實(shí)驗(yàn)還特意安排了血清抗體的快速親和純化這個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。這樣既降低了實(shí)驗(yàn)運(yùn)行的成本，又大大豐富了實(shí)驗(yàn)的內(nèi)容。要知道，抗體的親和純化即使對(duì)訓(xùn)練有素的研究人員來(lái)講也不是一件易事，但上海交大的學(xué)生卻能做得相當(dāng)不錯(cuò)，本書后所附彩色照片即可證明這一點(diǎn)。創(chuàng)新之處在本書的細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)部分也不乏實(shí)例，不擬累述。最后，還要對(duì)中國(guó)林業(yè)出版社徐平編審表示感謝，本書的面世與她的熱情幫助是分不開(kāi)的。在本書的出版過(guò)程中，徐平女士對(duì)于作者的悉心指點(diǎn)和極大的耐心都令人難忘，在此表示由衷的感謝。

內(nèi)容概要

　　《分子生物學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教程》為一本實(shí)驗(yàn)操作指導(dǎo)，分為分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)與細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)兩個(gè)部分。分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)包括大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒DNA的提取及瓊脂糖凝膠電泳、DNA重組、重組DNA的酶切鑒定、大腸桿菌中表達(dá)蛋白的超聲破碎抽提、蛋白質(zhì)的制備電泳、血清抗體的快速親和純化、免疫印跡、GST的親和純化及純化過(guò)程的SDS—PAGE分析等；細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)以四膜蟲(chóng)為主要實(shí)驗(yàn)材料，包括細(xì)胞計(jì)數(shù)、酸性磷酸酶染色、福爾根染色、姬姆薩染色、細(xì)胞核與纖毛的分離以及間接免疫酶標(biāo)染色顯示纖毛等實(shí)驗(yàn)，還補(bǔ)充了牛蛙骨髓細(xì)胞染色體的制備和CHO細(xì)胞中間纖維的免疫酶標(biāo)染色兩個(gè)實(shí)驗(yàn)?！　　斗肿由飳W(xué)與細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教程》可作為一般綜合性院校、師范院校和農(nóng)業(yè)院校有關(guān)專業(yè)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的教材或?qū)嶒?yàn)教學(xué)參考書，對(duì)有關(guān)的初、中級(jí)研究人員也有一定的參考價(jià)值。

書籍目錄

第一部分 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)的總體設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)日程安排實(shí)驗(yàn)一 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)二 質(zhì)粒DNA的提取實(shí)驗(yàn)三 質(zhì)粒DNA的瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)四 DNA重組實(shí)驗(yàn)五 轉(zhuǎn)化后細(xì)菌菌落的快速裂解及質(zhì)粒大小的檢查實(shí)驗(yàn)六 重組DNA的酶切鑒定實(shí)驗(yàn)七 大腸桿菌中表達(dá)的GFP的超聲破碎抽提實(shí)驗(yàn)八 GFP血清抗體的瓊脂免疫雙擴(kuò)散檢測(cè)實(shí)驗(yàn)九 非變性條件下GFP的制備電泳實(shí)驗(yàn)十 GFP血清抗體的快速親和純化實(shí)驗(yàn)十一 免疫印跡實(shí)驗(yàn)十二 GST的親和純化與純化過(guò)程的SDS．PAGE分析實(shí)驗(yàn)考勤及完成情況登記表第二部分 細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)四膜蟲(chóng)簡(jiǎn)介實(shí)驗(yàn)一 四膜蟲(chóng)的計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)二 一些化學(xué)試劑對(duì)四膜蟲(chóng)影響的觀察實(shí)驗(yàn)三 四膜蟲(chóng)吞噬的觀察及酸性磷酸酶染色實(shí)驗(yàn)四 福爾根染色顯示四膜蟲(chóng)細(xì)胞核DNA實(shí)驗(yàn)五 四膜蟲(chóng)饑餓誘導(dǎo)后接合行為與細(xì)胞核變化的姬姆薩染色觀察實(shí)驗(yàn)六 四膜蟲(chóng)細(xì)胞核與纖毛的分離實(shí)驗(yàn)七 間接免疫酶標(biāo)染色顯示四膜蟲(chóng)纖毛實(shí)驗(yàn)八 牛蛙骨髓細(xì)胞染色體的制備實(shí)驗(yàn)九 CH0細(xì)胞藥物合并離心處理后中間纖維的免疫酶標(biāo)染色主要參考文獻(xiàn)附錄一：GFP和GST血清抗體的制備附錄二：實(shí)驗(yàn)所需設(shè)備器材清單

章節(jié)摘錄

插圖：本實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)圍繞著綜合兩字展開(kāi)。它不是由彼此孤立的、相互間缺乏內(nèi)在聯(lián)系的一個(gè)個(gè)實(shí)驗(yàn)組成的，而是把生物學(xué)研究中最常用的那些分子生物學(xué)技術(shù)，以融合蛋白的表達(dá)和免疫印跡檢測(cè)為主線，按照邏輯順序有機(jī)地揉合在一起，構(gòu)成了一個(gè)前后連貫、相互呼應(yīng)的整體，從而體現(xiàn)了實(shí)驗(yàn)的綜合性。實(shí)驗(yàn)包括了從質(zhì)粒的提取、DNA凝膠電泳、融合蛋白的表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建、大腸桿菌中外源蛋白的表達(dá)、分離和制備電泳、血清抗體的快速親和純化，直到最后用純化的抗體去進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)等內(nèi)容。整個(gè)實(shí)驗(yàn)組成了一個(gè)系列，或者說(shuō)一條完整的鏈條，一環(huán)接一環(huán)，環(huán)環(huán)相扣，不可割裂。在修完本實(shí)驗(yàn)課程后，同學(xué)們對(duì)分子生物學(xué)最基本、最常用的技術(shù)應(yīng)該能夠比較熟悉，有些甚至基本掌握了。這將為同學(xué)們今后的學(xué)習(xí)和工作打下一個(gè)比較堅(jiān)實(shí)的分子操作的基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)的基本思路，是將目前生物學(xué)研究中最常使用的一種標(biāo)記蛋白——綠色熒光蛋白（GFP）的基因，與另一種經(jīng)常使用的工具性分子——蛋白谷胱苷肽轉(zhuǎn)移酶（GST）的基因連在一起，構(gòu)建成GSI-GFP融合蛋白的表達(dá)質(zhì)粒，令其在大腸桿菌中表達(dá)。之后，用經(jīng)親和純化的GFP血清抗體做免疫印跡，檢測(cè)是否有融合蛋白的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)分為兩個(gè)部分：前一部分是核酸的操作，構(gòu)建GST-GFP融合蛋白的表達(dá)質(zhì)粒；后一部分是蛋白的操作，包括GFP的分離和制備性電泳純化、血清抗體的快速親和純化和免疫印跡檢測(cè)。核酸部分的實(shí)驗(yàn)流程如圖0-1所示。

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《分子生物學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教程》是由中國(guó)林業(yè)出版社出版的。

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