冷泉港蛋白質組學實驗手冊

前言

　　21世紀是生命科學的世紀，這已成為人們的共識。生命科學隨著人類對自身和自然的認識、探索而萌芽，隨著人類生產和科學實踐的進步而發(fā)展。現(xiàn)代生命科學包括生物學、醫(yī)學、農學等傳統(tǒng)學科領域，以及生物學、生物技術與環(huán)境科學乃至社會科學等其他學科相互滲透、交叉而產生的新型學科體系。20世紀后葉，現(xiàn)代生物科學尤其是分子生物學取得了一系列突破性成就，使得生命科學在自然科學體系中的位置發(fā)生了革命性的變化，成為21世紀的帶頭學科。人們對生命科學也寄予了無限的期望，希望能夠解決人類社會所面臨的人口膨脹、資源匱乏、疾病危害、環(huán)境污染和生態(tài)破壞等一系列重大問題?；仡櫳茖W的發(fā)展歷程，實驗技術一直起著非常重要的促進作用。如17世紀Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ等人發(fā)明并應用顯微鏡技術，直接催生了“細胞學說”的建立和發(fā)展；1973年Ｃｏｈｎ和Ｂｏｙｅｒ完成了ＤＮＡ體外重組實驗，標志著基因工程的肇始；1988年Ｋａｒｙ  Ｍｕｌｌｉｓ發(fā)明的ＰＣＲ技術甚至使生命科學產生了飛躍性的發(fā)展?？梢哉f，生命科學每時每刻離不開實驗，實驗是開啟神奇的生命王國大門的鑰匙。沒有實驗技術的不斷進步，也就沒有生命科學今天的巨大發(fā)展；同時，生命科學的發(fā)展又對實驗技術提出了更高的要求，進一步刺激了后者的不斷進步。生命科學正是在“實驗催生和驗證著基礎理論，理論指導和發(fā)展了實驗技術”的不斷循環(huán)中從必然王國走向自由王國。工欲善其事，必先利其器。為了有助于生命科學工作者更多地了解相關實驗技術和儀器設備，更好地設計實驗方案，更有效地開展實驗過程，更合理地處理實驗結果，化學工業(yè)出版社組織出版了《生物實驗室系列》圖書。系列圖書在整體規(guī)劃的基礎上，本著“經(jīng)典、前沿、實用，理論與技術并重”的原則組織編寫，分批出版。在題材上，系列圖書涵蓋綜合實驗技術和單項實驗技術兩個方面。其中綜合實驗技術既有以實驗目的為題，如“蛋白質化學分析技術”，內容縱向覆蓋多項實驗技術；也有以某一生命學科領域的綜合實驗技術為題，如“發(fā)酵工程實驗技術”、“生物化學實驗技術”等。而單項實驗技術則以深入介紹某一專項技術及其應用為主，在闡述其基本原理的基礎上，橫向介紹該項技術在多個領域的應用，如“雙向電泳技術”、“流式細胞術”等。在內容上，系列圖書主要有以下兩個顯著特點。一是強調先進性——除了系統(tǒng)介紹常用和經(jīng)典實驗技術以外，特別突出了當前該領域實驗手段的新理論、新技術、新發(fā)展，為國內專業(yè)人員起到借鑒和引導作用。二是強調可操作性——對于每一項實驗技術，系統(tǒng)介紹其原理方法、設備儀器和實驗過程，讓讀者明了實驗的目的、方案設計以及具體步驟和結果處理，以期起到實驗指南的作用。本系列圖書堅持質量為先，開拓國內和國際兩個出版資源。一方面，邀請國內相關領域兼具理論造詣和豐富實驗室工作經(jīng)驗的專家學者編著；另一方面，時刻關注國際生命科學前沿領域和先進技術的進展，及時引進(翻譯或影印)國外知名出版社的權威力作?！渡飳嶒炇蚁盗小穲D書的讀者對象設定為國內從事生命科學及生物技術和相關領域(如醫(yī)學、藥學、農學)的專業(yè)研究人員，企業(yè)或公司的生產、研發(fā)、管理技術人員，以及高校相關專業(yè)的教師、研究生等。我們殷切希望《生物實驗室系列》圖書的出版能夠服務于我國生命科學的發(fā)展需要，同時熱忱歡迎從事和關心生命科學的廣大科技人員不僅對已出版圖書提供寶貴意見和建議，也能對系列圖書的后續(xù)題目設計貢獻良策或推薦作者，以便我們能夠集思廣益，將這一系列圖書沿著可持續(xù)發(fā)展的方向不斷豐富品種，推陳出新。謹向所有關心和熱愛生命科學，為生命科學的發(fā)展孜孜以求的科學工作者致以崇高的敬意！祝愿我國的科技事業(yè)如生命之樹根深葉茂，欣欣向榮！化學工業(yè)出版社生物·醫(yī)藥出版分社譯者的話基因組學研究揭示了生命的藍圖，而功能基因組學研究才能使我們真正了解生命的本質。蛋白質是生命活動的體現(xiàn)者，以其作為研究對象的蛋白質組學是功能基因組學研究的重要組成部分。由于蛋白質幾乎參與并主導了生物體中的任何一種生命活動，所以當疾病發(fā)生時其往往處于問題的核心，并且?guī)缀跛兴幬锒际峭ㄟ^修飾蛋白質功能起作用。這決定了蛋白質在疾病發(fā)病機理及防治研究中舉足輕重的地位。同時，正是由于蛋白質參與了各種各樣、形形色色的生命活動，使其具有獨特的化學特性，遠比通過以較為單一的氫鍵配對形成的DNA復雜得多。因此，針對蛋白質研究的方法也多種多樣，并且隨著物理、化學等其他學科的發(fā)展，不斷產生新的研究方法。但是，這些方法無論在成熟度還是在高通量方面都需要進一步發(fā)展。為了迎接蛋白質組學研究時代的到來， Andrew J?Link和Joshua LaBaer教授通過對學生6年多來的蛋白質組學課程的教學實踐，在不斷修改與完善的基礎上，總結出版了本書，包括各種蛋白質制備和分離方法、質譜分析的一般方法、用于蛋白質表達的編碼序列的高通量克隆、蛋白質芯片的制備和使用以及驗證這些數(shù)據(jù)的分析方法等內容。冷泉港實驗室的《分子克隆實驗指南》曾影響了一代又一代國內的分子生物學研究的科學工作者，希望本書也能對國內蛋白質組學研究起到一定的推動作用。中國食品藥品檢定研究院和軍事醫(yī)學科學院生物工程研究所的相關實驗室多年來一直從事蛋白質組學研究工作，在化學工業(yè)出版社的大力支持下，近年來在學習與工作之余組織了工作在科研一線的研究人員和研究生翻譯了包括該手冊在內的多本蛋白質組學專著。 由于蛋白質組學的快速發(fā)展，而我們的知識有限，譯文中難免存在疏漏和謬誤之處，懇請同行和廣大讀者不吝指正，譯者將不勝感激。譯者

內容概要

　　本書為美國冷泉港實驗室蛋白質組學課程培訓用書，為蛋白質組學工作者案頭必備實驗手冊。內容涉及各種蛋白質制備和分離方法、質譜分析的一般方法、用于蛋白質表達的編碼序列的高通量克隆、蛋白質芯片的制備和使用以及驗證這些數(shù)據(jù)的分析方法等內容。書中附有大量的以step-by-step形式展現(xiàn)的操作程序，針對關鍵性步驟增加說明性文字加以點撥，并有信息框闡述關鍵的知識點，具有很強的實用性和可操作性。本書適用于生物、醫(yī)學基礎和藥學等專業(yè)研究生、高年級本科生和相關研究人員查閱參考。

書籍目錄

簡介1實驗1全細胞裂解物的雙向凝膠電泳和MALDI 質譜分析
操作程序1.1酵母細胞裂解液的制備
操作程序1.2IPG膠條的再水化和等電聚焦
操作程序1.3等電聚焦膠條的平衡
操作程序1.4第二向--SDS.PAGE
操作程序1.5用SYPRO Ruby進行全蛋白染色
操作程序1.6用Pro.Q Diamond進行磷酸化蛋白染色
操作程序1.7用Pro.Q Emerald進行糖蛋白染色
操作程序1.8用考馬斯亮藍進行全蛋白染色
操作程序1.9用質譜兼容的銀染進行全蛋白染色
操作程序1.102D膠的圖像分析和蛋白質回收
操作程序1.11膠內酶切
操作程序1.12MALDI點靶29實驗2用于質譜分析的蛋白質復合物的純化
操作程序2.1培養(yǎng)并收集TAP標記的酵母細胞
操作程序2.2為純化TAP標記蛋白質復合物制備酵母細胞抽提物
操作程序2.3第一步親和富集--利用IgG親和色譜從酵母抽提物中捕獲TAP標記的蛋白質復合物
操作程序2.4第二步親和富集--TAP.標記的蛋白質復合物的鈣調蛋白親和色譜
操作程序2.5與磁珠的結合
操作程序2.6蛋白質復合物的親和純化
實驗3用MALDI TOF/TOF串聯(lián)質譜進行肽的定性和定量分析
操作程序3.1實驗描述
實驗4蛋白質復合物分析--高靈敏液相色譜與串聯(lián)質譜聯(lián)用
操作程序4.1HPLC柱毛細管的制作
操作程序4.2填裝微毛細管FSC柱
操作程序4.3微毛細管RP.HPLC與ESI.質譜聯(lián)用
實驗5用IMAC和質譜分析磷酸化肽
操作程序5.1制備IMAC樣品
操作程序5.2制備IMAC柱和反相捕獲柱（前柱）
操作程序5.3制備IMAC柱
操作程序5.4樣品處理
實驗6全細胞裂解物的多維蛋白質鑒定技術分析
操作程序6.1使用多維蛋白質鑒定技術分析全細胞裂解物
實驗7全細胞提取物的定量質譜檢測技術(iTRAQ)
操作程序7.1從酵母細胞制備肽
操作程序7.2以iTRAQ試劑標記肽
操作程序7.3應用反向色譜柱提純肽
操作程序7.4多肽等電聚焦95實驗8串聯(lián)質譜數(shù)據(jù)的分析及確認
操作程序8.1使用Global Proteome Machine系統(tǒng)分析LC.MS/MS數(shù)據(jù)
操作程序8.2使用ProteinPilot軟件進行肽段和蛋白質鑒定
操作程序8.3對數(shù)據(jù)庫檢索程序鑒定為能夠匹配肽段序列的MS/MS譜圖
進行評價118實驗9開放閱讀框的高通量克隆--構建大量表達結構
操作程序9.1利用Gateway LR反應構造表達結構
操作程序9.2用Gateway LR反應產物化學轉化感受態(tài)細菌
實驗10蛋白質微陣列的構建--核酸可編程性蛋白質陣列
操作程序10.1用氨基甲硅烷包被載玻片
操作程序10.2在96孔板中制備細菌的培養(yǎng)物
操作程序10.3從96孔板中分離質粒DNA
操作程序10.4DNA的生物素化、沉淀及樣品布陣
操作程序10.5NAPPA載玻片上蛋白質的表達
操作程序10.6檢測NAPPA載玻片上的蛋白質
操作程序10.7在NAPPA芯片上測定DNA151
實驗11使用核酸可編程性蛋白質陣列鑒定蛋白質.蛋白質相互作用
操作程序11.1NAPPA芯片與查詢蛋白共表達
操作程序11.2在NAPPA芯片上檢測查詢蛋白
附錄1鈉升電噴霧電離離子源和串聯(lián)質譜裝置和示范
附錄2溶液內蛋白質的消化
附錄3凝膠內胰酶消化已分離蛋白
附錄4三氯乙酸蛋白質沉淀法
附錄5氨基酸的單同位素和亞銨離子分子量
附錄6氨基酸二肽分子量
附錄7LTQ離子阱的使用方法
附錄8肽段混合物離線去鹽
附錄9感受態(tài)細胞的制備
附錄10DNA的定量
附錄11注意事項
索引

章節(jié)摘錄

　　開始解析結果之前，記住以下幾個關鍵點是非常重要的。數(shù)據(jù)庫檢索是沒有偏向性的。數(shù)據(jù)庫中所有的蛋白質和肽段序列都會與每個MS／MS譜圖進行常規(guī)對比。檢索引擎不會做關于樣品中可能存在什么蛋白質的任何假設。這也許是此技術最為重要和最為有力的方面。出乎預期的蛋白質能夠被鑒定到，研究者可能沒有預計到這些蛋白質會在樣品中存在。只有蛋白質數(shù)據(jù)庫中存在的肽段和蛋白質會在輸出文件中列出。如果一個蛋白質或肽段的序列不在數(shù)據(jù)庫中，那它將不會被鑒定到。檢索算法不會進行MS／MS譜圖的從頭序列分析（de novo sequencing）并產生肽段序列。程序只會使用設置的參數(shù)將數(shù)據(jù)庫中的肽段序列與MS／MS譜圖進行匹配。分子量大的蛋白質與分子量小的蛋白質相比，更容易被鑒定到。LC—MS／MS方法只會將樣品中胰酶消化后的全部肽段中的一部分進行碎裂。一個蛋白質經(jīng)胰酶消化后產生的肽段越多，此蛋白質產生的肽段被選擇進行碎裂的機會就越多。分子量小的蛋白質經(jīng)胰酶消化后只會產生很少的幾個肽段，有可能會逃脫檢測。LC—MS／MS和MALDI—MS方法在碎裂來源于高峰度蛋白的肽段時存在偏好性。由于選擇母離子用于碎裂的過程通常根據(jù)離子峰的強度，因此離子強度較強的峰將被選擇進行碎裂，一而離子強度較弱的峰將會被忽略并很可能逃脫碎裂。盡管肽段離子化的效率不同，但是平均來講，一個肽段或蛋白質的豐度越高，產生具有強信號母離子肽段的可能性就越大。低豐度肽段和蛋白質會逃脫檢測。發(fā)生未知氨基酸改變或替換的肽段不會匹配到蛋白質數(shù)據(jù)庫中的任一序列，也不會被列出。再一次說明，不在數(shù)據(jù)庫中的蛋白質序列不會被鑒定到。某些數(shù)據(jù)庫檢索程序可以進行稱之為“同源性”（homology）的檢索，這種檢索方式允許存在氨基酸替換。任何具有在檢索參數(shù)中沒有指明的修飾氨基酸的肽段將不會被列出。這些肽段將會逃脫檢測。檢索程序只會檢索并列出那些具有檢索參數(shù)中已包含的修飾氨基酸的肽段。既然LC—MS／MS的優(yōu)缺點都與數(shù)據(jù)庫檢索分析息息相關，下面我們將描述一個用于初步評價數(shù)據(jù)庫檢索結果的方法。

圖書封面

評論、評分、閱讀與下載

---

    冷泉港蛋白質組學實驗手冊 PDF格式下載

---