冷泉港蛋白質(zhì)組學實驗手冊

前言

　　21世紀是生命科學的世紀，這已成為人們的共識。生命科學隨著人類對自身和自然的認識、探索而萌芽，隨著人類生產(chǎn)和科學實踐的進步而發(fā)展。現(xiàn)代生命科學包括生物學、醫(yī)學、農(nóng)學等傳統(tǒng)學科領(lǐng)域，以及生物學、生物技術(shù)與環(huán)境科學乃至社會科學等其他學科相互滲透、交叉而產(chǎn)生的新型學科體系。20世紀后葉，現(xiàn)代生物科學尤其是分子生物學取得了一系列突破性成就，使得生命科學在自然科學體系中的位置發(fā)生了革命性的變化，成為21世紀的帶頭學科。人們對生命科學也寄予了無限的期望，希望能夠解決人類社會所面臨的人口膨脹、資源匱乏、疾病危害、環(huán)境污染和生態(tài)破壞等一系列重大問題?；仡櫳茖W的發(fā)展歷程，實驗技術(shù)一直起著非常重要的促進作用。如17世紀Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ等人發(fā)明并應(yīng)用顯微鏡技術(shù)，直接催生了“細胞學說”的建立和發(fā)展；1973年Ｃｏｈｎ和Ｂｏｙｅｒ完成了ＤＮＡ體外重組實驗，標志著基因工程的肇始；1988年Ｋａｒｙ  Ｍｕｌｌｉｓ發(fā)明的ＰＣＲ技術(shù)甚至使生命科學產(chǎn)生了飛躍性的發(fā)展?？梢哉f，生命科學每時每刻離不開實驗，實驗是開啟神奇的生命王國大門的鑰匙。沒有實驗技術(shù)的不斷進步，也就沒有生命科學今天的巨大發(fā)展；同時，生命科學的發(fā)展又對實驗技術(shù)提出了更高的要求，進一步刺激了后者的不斷進步。生命科學正是在“實驗催生和驗證著基礎(chǔ)理論，理論指導(dǎo)和發(fā)展了實驗技術(shù)”的不斷循環(huán)中從必然王國走向自由王國。工欲善其事，必先利其器。為了有助于生命科學工作者更多地了解相關(guān)實驗技術(shù)和儀器設(shè)備，更好地設(shè)計實驗方案，更有效地開展實驗過程，更合理地處理實驗結(jié)果，化學工業(yè)出版社組織出版了《生物實驗室系列》圖書。系列圖書在整體規(guī)劃的基礎(chǔ)上，本著“經(jīng)典、前沿、實用，理論與技術(shù)并重”的原則組織編寫，分批出版。在題材上，系列圖書涵蓋綜合實驗技術(shù)和單項實驗技術(shù)兩個方面。其中綜合實驗技術(shù)既有以實驗?zāi)康臑轭}，如“蛋白質(zhì)化學分析技術(shù)”，內(nèi)容縱向覆蓋多項實驗技術(shù)；也有以某一生命學科領(lǐng)域的綜合實驗技術(shù)為題，如“發(fā)酵工程實驗技術(shù)”、“生物化學實驗技術(shù)”等。而單項實驗技術(shù)則以深入介紹某一專項技術(shù)及其應(yīng)用為主，在闡述其基本原理的基礎(chǔ)上，橫向介紹該項技術(shù)在多個領(lǐng)域的應(yīng)用，如“雙向電泳技術(shù)”、“流式細胞術(shù)”等。在內(nèi)容上，系列圖書主要有以下兩個顯著特點。一是強調(diào)先進性——除了系統(tǒng)介紹常用和經(jīng)典實驗技術(shù)以外，特別突出了當前該領(lǐng)域?qū)嶒炇侄蔚男吕碚摗⑿录夹g(shù)、新發(fā)展，為國內(nèi)專業(yè)人員起到借鑒和引導(dǎo)作用。二是強調(diào)可操作性——對于每一項實驗技術(shù)，系統(tǒng)介紹其原理方法、設(shè)備儀器和實驗過程，讓讀者明了實驗的目的、方案設(shè)計以及具體步驟和結(jié)果處理，以期起到實驗指南的作用。本系列圖書堅持質(zhì)量為先，開拓國內(nèi)和國際兩個出版資源。一方面，邀請國內(nèi)相關(guān)領(lǐng)域兼具理論造詣和豐富實驗室工作經(jīng)驗的專家學者編著；另一方面，時刻關(guān)注國際生命科學前沿領(lǐng)域和先進技術(shù)的進展，及時引進(翻譯或影印)國外知名出版社的權(quán)威力作?！渡飳嶒炇蚁盗小穲D書的讀者對象設(shè)定為國內(nèi)從事生命科學及生物技術(shù)和相關(guān)領(lǐng)域(如醫(yī)學、藥學、農(nóng)學)的專業(yè)研究人員，企業(yè)或公司的生產(chǎn)、研發(fā)、管理技術(shù)人員，以及高校相關(guān)專業(yè)的教師、研究生等。我們殷切希望《生物實驗室系列》圖書的出版能夠服務(wù)于我國生命科學的發(fā)展需要，同時熱忱歡迎從事和關(guān)心生命科學的廣大科技人員不僅對已出版圖書提供寶貴意見和建議，也能對系列圖書的后續(xù)題目設(shè)計貢獻良策或推薦作者，以便我們能夠集思廣益，將這一系列圖書沿著可持續(xù)發(fā)展的方向不斷豐富品種，推陳出新。謹向所有關(guān)心和熱愛生命科學，為生命科學的發(fā)展孜孜以求的科學工作者致以崇高的敬意！祝愿我國的科技事業(yè)如生命之樹根深葉茂，欣欣向榮！化學工業(yè)出版社生物·醫(yī)藥出版分社譯者的話基因組學研究揭示了生命的藍圖，而功能基因組學研究才能使我們真正了解生命的本質(zhì)。蛋白質(zhì)是生命活動的體現(xiàn)者，以其作為研究對象的蛋白質(zhì)組學是功能基因組學研究的重要組成部分。由于蛋白質(zhì)幾乎參與并主導(dǎo)了生物體中的任何一種生命活動，所以當疾病發(fā)生時其往往處于問題的核心，并且?guī)缀跛兴幬锒际峭ㄟ^修飾蛋白質(zhì)功能起作用。這決定了蛋白質(zhì)在疾病發(fā)病機理及防治研究中舉足輕重的地位。同時，正是由于蛋白質(zhì)參與了各種各樣、形形色色的生命活動，使其具有獨特的化學特性，遠比通過以較為單一的氫鍵配對形成的DNA復(fù)雜得多。因此，針對蛋白質(zhì)研究的方法也多種多樣，并且隨著物理、化學等其他學科的發(fā)展，不斷產(chǎn)生新的研究方法。但是，這些方法無論在成熟度還是在高通量方面都需要進一步發(fā)展。為了迎接蛋白質(zhì)組學研究時代的到來， Andrew J?Link和Joshua LaBaer教授通過對學生6年多來的蛋白質(zhì)組學課程的教學實踐，在不斷修改與完善的基礎(chǔ)上，總結(jié)出版了本書，包括各種蛋白質(zhì)制備和分離方法、質(zhì)譜分析的一般方法、用于蛋白質(zhì)表達的編碼序列的高通量克隆、蛋白質(zhì)芯片的制備和使用以及驗證這些數(shù)據(jù)的分析方法等內(nèi)容。冷泉港實驗室的《分子克隆實驗指南》曾影響了一代又一代國內(nèi)的分子生物學研究的科學工作者，希望本書也能對國內(nèi)蛋白質(zhì)組學研究起到一定的推動作用。中國食品藥品檢定研究院和軍事醫(yī)學科學院生物工程研究所的相關(guān)實驗室多年來一直從事蛋白質(zhì)組學研究工作，在化學工業(yè)出版社的大力支持下，近年來在學習與工作之余組織了工作在科研一線的研究人員和研究生翻譯了包括該手冊在內(nèi)的多本蛋白質(zhì)組學專著。 由于蛋白質(zhì)組學的快速發(fā)展，而我們的知識有限，譯文中難免存在疏漏和謬誤之處，懇請同行和廣大讀者不吝指正，譯者將不勝感激。譯者

內(nèi)容概要

　　本書為美國冷泉港實驗室蛋白質(zhì)組學課程培訓(xùn)用書，為蛋白質(zhì)組學工作者案頭必備實驗手冊。內(nèi)容涉及各種蛋白質(zhì)制備和分離方法、質(zhì)譜分析的一般方法、用于蛋白質(zhì)表達的編碼序列的高通量克隆、蛋白質(zhì)芯片的制備和使用以及驗證這些數(shù)據(jù)的分析方法等內(nèi)容。書中附有大量的以step-by-step形式展現(xiàn)的操作程序，針對關(guān)鍵性步驟增加說明性文字加以點撥，并有信息框闡述關(guān)鍵的知識點，具有很強的實用性和可操作性。本書適用于生物、醫(yī)學基礎(chǔ)和藥學等專業(yè)研究生、高年級本科生和相關(guān)研究人員查閱參考。

書籍目錄

簡介1實驗1全細胞裂解物的雙向凝膠電泳和MALDI 質(zhì)譜分析
操作程序1.1酵母細胞裂解液的制備
操作程序1.2IPG膠條的再水化和等電聚焦
操作程序1.3等電聚焦膠條的平衡
操作程序1.4第二向--SDS.PAGE
操作程序1.5用SYPRO Ruby進行全蛋白染色
操作程序1.6用Pro.Q Diamond進行磷酸化蛋白染色
操作程序1.7用Pro.Q Emerald進行糖蛋白染色
操作程序1.8用考馬斯亮藍進行全蛋白染色
操作程序1.9用質(zhì)譜兼容的銀染進行全蛋白染色
操作程序1.102D膠的圖像分析和蛋白質(zhì)回收
操作程序1.11膠內(nèi)酶切
操作程序1.12MALDI點靶29實驗2用于質(zhì)譜分析的蛋白質(zhì)復(fù)合物的純化
操作程序2.1培養(yǎng)并收集TAP標記的酵母細胞
操作程序2.2為純化TAP標記蛋白質(zhì)復(fù)合物制備酵母細胞抽提物
操作程序2.3第一步親和富集--利用IgG親和色譜從酵母抽提物中捕獲TAP標記的蛋白質(zhì)復(fù)合物
操作程序2.4第二步親和富集--TAP.標記的蛋白質(zhì)復(fù)合物的鈣調(diào)蛋白親和色譜
操作程序2.5與磁珠的結(jié)合
操作程序2.6蛋白質(zhì)復(fù)合物的親和純化
實驗3用MALDI TOF/TOF串聯(lián)質(zhì)譜進行肽的定性和定量分析
操作程序3.1實驗描述
實驗4蛋白質(zhì)復(fù)合物分析--高靈敏液相色譜與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用
操作程序4.1HPLC柱毛細管的制作
操作程序4.2填裝微毛細管FSC柱
操作程序4.3微毛細管RP.HPLC與ESI.質(zhì)譜聯(lián)用
實驗5用IMAC和質(zhì)譜分析磷酸化肽
操作程序5.1制備IMAC樣品
操作程序5.2制備IMAC柱和反相捕獲柱（前柱）
操作程序5.3制備IMAC柱
操作程序5.4樣品處理
實驗6全細胞裂解物的多維蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)分析
操作程序6.1使用多維蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)分析全細胞裂解物
實驗7全細胞提取物的定量質(zhì)譜檢測技術(shù)(iTRAQ)
操作程序7.1從酵母細胞制備肽
操作程序7.2以iTRAQ試劑標記肽
操作程序7.3應(yīng)用反向色譜柱提純肽
操作程序7.4多肽等電聚焦95實驗8串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)的分析及確認
操作程序8.1使用Global Proteome Machine系統(tǒng)分析LC.MS/MS數(shù)據(jù)
操作程序8.2使用ProteinPilot軟件進行肽段和蛋白質(zhì)鑒定
操作程序8.3對數(shù)據(jù)庫檢索程序鑒定為能夠匹配肽段序列的MS/MS譜圖
進行評價118實驗9開放閱讀框的高通量克隆--構(gòu)建大量表達結(jié)構(gòu)
操作程序9.1利用Gateway LR反應(yīng)構(gòu)造表達結(jié)構(gòu)
操作程序9.2用Gateway LR反應(yīng)產(chǎn)物化學轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌
實驗10蛋白質(zhì)微陣列的構(gòu)建--核酸可編程性蛋白質(zhì)陣列
操作程序10.1用氨基甲硅烷包被載玻片
操作程序10.2在96孔板中制備細菌的培養(yǎng)物
操作程序10.3從96孔板中分離質(zhì)粒DNA
操作程序10.4DNA的生物素化、沉淀及樣品布陣
操作程序10.5NAPPA載玻片上蛋白質(zhì)的表達
操作程序10.6檢測NAPPA載玻片上的蛋白質(zhì)
操作程序10.7在NAPPA芯片上測定DNA151
實驗11使用核酸可編程性蛋白質(zhì)陣列鑒定蛋白質(zhì).蛋白質(zhì)相互作用
操作程序11.1NAPPA芯片與查詢蛋白共表達
操作程序11.2在NAPPA芯片上檢測查詢蛋白
附錄1鈉升電噴霧電離離子源和串聯(lián)質(zhì)譜裝置和示范
附錄2溶液內(nèi)蛋白質(zhì)的消化
附錄3凝膠內(nèi)胰酶消化已分離蛋白
附錄4三氯乙酸蛋白質(zhì)沉淀法
附錄5氨基酸的單同位素和亞銨離子分子量
附錄6氨基酸二肽分子量
附錄7LTQ離子阱的使用方法
附錄8肽段混合物離線去鹽
附錄9感受態(tài)細胞的制備
附錄10DNA的定量
附錄11注意事項
索引

章節(jié)摘錄

　　開始解析結(jié)果之前，記住以下幾個關(guān)鍵點是非常重要的。數(shù)據(jù)庫檢索是沒有偏向性的。數(shù)據(jù)庫中所有的蛋白質(zhì)和肽段序列都會與每個MS／MS譜圖進行常規(guī)對比。檢索引擎不會做關(guān)于樣品中可能存在什么蛋白質(zhì)的任何假設(shè)。這也許是此技術(shù)最為重要和最為有力的方面。出乎預(yù)期的蛋白質(zhì)能夠被鑒定到，研究者可能沒有預(yù)計到這些蛋白質(zhì)會在樣品中存在。只有蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中存在的肽段和蛋白質(zhì)會在輸出文件中列出。如果一個蛋白質(zhì)或肽段的序列不在數(shù)據(jù)庫中，那它將不會被鑒定到。檢索算法不會進行MS／MS譜圖的從頭序列分析（de novo sequencing）并產(chǎn)生肽段序列。程序只會使用設(shè)置的參數(shù)將數(shù)據(jù)庫中的肽段序列與MS／MS譜圖進行匹配。分子量大的蛋白質(zhì)與分子量小的蛋白質(zhì)相比，更容易被鑒定到。LC—MS／MS方法只會將樣品中胰酶消化后的全部肽段中的一部分進行碎裂。一個蛋白質(zhì)經(jīng)胰酶消化后產(chǎn)生的肽段越多，此蛋白質(zhì)產(chǎn)生的肽段被選擇進行碎裂的機會就越多。分子量小的蛋白質(zhì)經(jīng)胰酶消化后只會產(chǎn)生很少的幾個肽段，有可能會逃脫檢測。LC—MS／MS和MALDI—MS方法在碎裂來源于高峰度蛋白的肽段時存在偏好性。由于選擇母離子用于碎裂的過程通常根據(jù)離子峰的強度，因此離子強度較強的峰將被選擇進行碎裂，一而離子強度較弱的峰將會被忽略并很可能逃脫碎裂。盡管肽段離子化的效率不同，但是平均來講，一個肽段或蛋白質(zhì)的豐度越高，產(chǎn)生具有強信號母離子肽段的可能性就越大。低豐度肽段和蛋白質(zhì)會逃脫檢測。發(fā)生未知氨基酸改變或替換的肽段不會匹配到蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中的任一序列，也不會被列出。再一次說明，不在數(shù)據(jù)庫中的蛋白質(zhì)序列不會被鑒定到。某些數(shù)據(jù)庫檢索程序可以進行稱之為“同源性”（homology）的檢索，這種檢索方式允許存在氨基酸替換。任何具有在檢索參數(shù)中沒有指明的修飾氨基酸的肽段將不會被列出。這些肽段將會逃脫檢測。檢索程序只會檢索并列出那些具有檢索參數(shù)中已包含的修飾氨基酸的肽段。既然LC—MS／MS的優(yōu)缺點都與數(shù)據(jù)庫檢索分析息息相關(guān)，下面我們將描述一個用于初步評價數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果的方法。

圖書封面

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