基因操作技術(shù)

內(nèi)容概要

本書為國(guó)家示范性高職院校一線教師和企業(yè)專家共同開發(fā)的教改成果教材。本書按照DNA重組技術(shù)的操作程序來(lái)安排實(shí)驗(yàn)，即從核酸的提取→目的基因的制備→體外DNA的重組(酶切與連接)→重組DNA分子引入受體細(xì)胞→轉(zhuǎn)化子的篩選→重組DNA分子的鑒定等步驟編排成一個(gè)綜合性大實(shí)驗(yàn)。在這個(gè)綜合性實(shí)驗(yàn)中，每一步實(shí)驗(yàn)既相對(duì)獨(dú)立又與下一步實(shí)驗(yàn)緊密相連。通過(guò)這些實(shí)驗(yàn)，學(xué)生可以熟練掌握分子生物學(xué)最基本的技術(shù)，并對(duì)DNA重組技術(shù)有一個(gè)比較全面而系統(tǒng)的概念。書中同時(shí)穿插了分子生物學(xué)其他必備的實(shí)驗(yàn)，以便培養(yǎng)學(xué)生比較全面的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技能。本書分為6個(gè)項(xiàng)目，每個(gè)項(xiàng)目由若干個(gè)任務(wù)組成，并且有“必備知識(shí)”作為任務(wù)的理論補(bǔ)充，“拓展知識(shí)”可以擴(kuò)展學(xué)生的知識(shí)面，“項(xiàng)目思考”中設(shè)計(jì)的問(wèn)題有助于培養(yǎng)學(xué)生獨(dú)立思考能力和創(chuàng)新意識(shí)。    本書可作為高職高專生物技術(shù)相關(guān)專業(yè)的教材，也可供相關(guān)技術(shù)人員參考。

書籍目錄

項(xiàng)目一  質(zhì)粒pMD18-T-EGFP的分離、純化和鑒定  一、項(xiàng)目介紹  二、學(xué)習(xí)目標(biāo)  三、項(xiàng)目實(shí)施    任務(wù)一  創(chuàng)建和諧包容性的工作環(huán)境    任務(wù)二  清洗、包扎常用玻璃器皿和耗材    任務(wù)三  配制并滅菌各種濃度單位的溶液    任務(wù)四  創(chuàng)建遺傳信息流示意圖    任務(wù)五  堿裂解法分離提取質(zhì)粒pMD18-T-EGFP及濃度測(cè)定    任務(wù)六  瓊脂糖凝膠電泳鑒定質(zhì)粒pMD18-T-EGFP    任務(wù)七  細(xì)菌基因組DNA提取及質(zhì)量檢測(cè)  四、項(xiàng)目思考  五、必備知識(shí)    （一）基因工程的發(fā)展簡(jiǎn)史    （二）基因工程實(shí)驗(yàn)規(guī)范    （三）溶液濃度的計(jì)算與換算    （四）生物學(xué)遺傳信息流    （五）DNA的結(jié)構(gòu)    （六）核酸的理化性質(zhì)    （七）乳糖操縱元    （八）載體（一）  六、拓展知識(shí)    （一）基因組大小與基因數(shù)量    （二）基因操作對(duì)人類生存環(huán)境的影響    （三）真核生物DNA的提取    （四）真核基因組DNA的制備技術(shù)項(xiàng)目二  綠色熒光蛋白基因(egfp)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA的提取  一、項(xiàng)目介紹  二、學(xué)習(xí)目標(biāo)  三、項(xiàng)目實(shí)施    任務(wù)一  總RNA的提取及含量測(cè)定    任務(wù)二  mRNA的提取與純化    任務(wù)三  RNA瓊脂糖凝膠電泳    任務(wù)四  Northern blot  四、項(xiàng)目思考  五、必備知識(shí)    (一)RNA操作注意事項(xiàng)    (二)RNA的空間結(jié)構(gòu)和功能    (三)mRNA的合成與加工  六、拓展知識(shí)    (一)植物病毒的RNA提取    (二)動(dòng)植物組織mRNA提取    (三)兔肝RNA的制備    (四)人體細(xì)胞總RNA和mRNA的提取項(xiàng)目三  體外擴(kuò)增目的基因——綠色熒光蛋白基因（egfp）  一、項(xiàng)目介紹  二、學(xué)習(xí)目標(biāo)  三、項(xiàng)目實(shí)施    任務(wù)一  以DNA為模板擴(kuò)增綠色熒光蛋白基因（egfp）——PCR    任務(wù)二  以mRNA為模板反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增綠色熒光蛋白基因——RT-PCR    任務(wù)三  實(shí)時(shí)熒光系統(tǒng)通過(guò)反轉(zhuǎn)錄定量（RT-qPCR）對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行分析    任務(wù)四  cDNA文庫(kù)構(gòu)建技術(shù)（一）——磁珠法提純mRNA    任務(wù)五  cDNA文庫(kù)構(gòu)建技術(shù)（二）——cDNA鏈的反轉(zhuǎn)合成  四、項(xiàng)目思考  五、必備知識(shí)    （一）DNA的生物合成    （二）RNA的生物合成    （三）DNA聚合酶的類別和性質(zhì)    （四）其他工具酶    （五）PCR技術(shù)及其在基因克隆中的應(yīng)用    （六）PCR產(chǎn)物的克隆  六、拓展知識(shí)    （一）巢式PCR    （二）cDNA文庫(kù)構(gòu)建技術(shù)項(xiàng)目四  將綠色熒光蛋白基因（egfp）克隆到載體上  一、項(xiàng)目介紹  二、學(xué)習(xí)目標(biāo)  三、項(xiàng)目實(shí)施    任務(wù)一  利用內(nèi)切酶對(duì)載體和基因（egfp）進(jìn)行酶切    任務(wù)二  酶切片段的脫磷技術(shù)    任務(wù)三  DNA片段的回收技術(shù)    任務(wù)四  基因的重組連接技術(shù)    任務(wù)五  cDNA文庫(kù)構(gòu)建技術(shù)（三）——cDNA的連接、包裝及轉(zhuǎn)染    任務(wù)六  RACE技術(shù)擴(kuò)增構(gòu)建全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)  四、項(xiàng)目思考  五、必備知識(shí)    （一）限制性內(nèi)切酶分類和催化機(jī)制    （二）DNA甲基化酶    （三）DNA連接酶    （四）其他工具酶的催化機(jī)制    （五）載體（二）  六、拓展知識(shí)    （一）分子標(biāo)記    （二）RFLP技術(shù)    （三）RAPD技術(shù)    （四）AFLP技術(shù)    （五）SSR技術(shù)項(xiàng)目五  將含有egfp基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coli中  一、項(xiàng)目介紹  二、學(xué)習(xí)目標(biāo)  三、項(xiàng)目實(shí)施    任務(wù)一  準(zhǔn)備溶液及器皿    任務(wù)二  感受態(tài)細(xì)胞的制備及熱激法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coli中    任務(wù)三  感受態(tài)細(xì)胞的制備及電擊法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coli中    任務(wù)四  農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞    任務(wù)五  磷酸鈣轉(zhuǎn)染動(dòng)物細(xì)胞  四、項(xiàng)目思考  五、必備知識(shí)    （一）感受態(tài)細(xì)胞    （二）外源基因?qū)胝婧思?xì)胞的方法    （三）目的基因的篩選策略  六、拓展知識(shí)    （一）基因打靶技術(shù)    （二）從基因到基因組項(xiàng)目六  基因（egfp）及基因產(chǎn)物(EGFP)檢測(cè)參考文獻(xiàn)

章節(jié)摘錄

　　（5）玻璃和塑料器皿的干燥實(shí)驗(yàn)中用到的玻璃和塑料器皿經(jīng)常需要干燥，通常都是用烘箱或烘干機(jī)在110～120~C：進(jìn)行干燥，而不要用丙酮蕩洗再吹干的方法來(lái)干燥，因?yàn)槟菢訒?huì)有殘留的有機(jī)物覆蓋在器皿的內(nèi)表面。硝酸纖維素的塑料離心管加熱時(shí)會(huì)發(fā)生爆炸，所以絕不能放在烘箱中干燥，只能用冷風(fēng)吹干。2。洗液的配制（1）常用洗液的配制如遇玻璃器皿用上述方法不能洗凈者，可用下列清洗液浸泡后洗刷。因已確定鉻有致癌作用，因此配制和使用洗液時(shí)要極為小心，常用的兩種配制方法如下?！　、偃?00mL工業(yè)濃硫酸置于燒杯內(nèi)，小心加熱，然后慢慢加入5g重鉻酸鉀粉末，邊加邊攪拌，待全部溶解并緩慢冷卻后，儲(chǔ)存在磨口玻璃塞的細(xì)口瓶?jī)?nèi)?！　、诜Q取5g重鉻酸鉀粉末，置于250mL燒杯中，加5mL水使其溶解，然后慢慢加入100mI。濃硫酸，溶液溫度將達(dá)80℃，待其冷卻后儲(chǔ)存于磨口玻璃瓶?jī)?nèi)?！　。?）其他洗液　?、俟I(yè)濃鹽酸：可洗去水垢或某些無(wú)機(jī)鹽沉淀。　?、?％草酸溶液：用數(shù)滴硫酸酸化，可洗去高錳酸鉀的痕跡。　?、?％～10％磷酸三鈉（Na3P04·12H20）溶液：可洗滌油污物?！　、?0％硝酸溶液：洗滌二氧化碳測(cè)定儀及微量滴管?！　、?％～10％乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Naz）溶液：加熱煮沸可洗脫玻璃儀器內(nèi)壁的白色沉淀物?！　、弈蛩叵礈煲海簽榈鞍踪|(zhì)的良好溶劑，適用于洗滌盛過(guò)蛋白質(zhì)制劑及血樣的容器?！　、哂袡C(jī)溶劑：如丙酮、乙醚、乙醇等可用于洗脫油脂、脂溶性染料污痕等，二甲苯可洗脫油漆的污垢。　?、鄽溲趸浀囊掖既芤汉秃懈咤i酸鉀的氫氧化鈉溶液：這是兩種強(qiáng)堿性的洗滌液，對(duì)玻璃儀器的侵蝕性很強(qiáng)，可清除容器內(nèi)壁污垢，洗滌時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，使用時(shí)應(yīng)小心慎重?！　、嶂劂t酸鉀（工業(yè)用）80g、粗硫酸100mL、水1000mL配成的洗液：將玻璃器皿浸泡24h后取出用水沖刷干凈。清潔液經(jīng)反復(fù)使用變黑，重?fù)Q新液。此液腐蝕性強(qiáng)，用時(shí)切勿觸及皮膚或衣服等，可戴上橡膠手套和穿上橡膠圍裙操作。3。玻璃器皿的包裝（1）培養(yǎng)皿將合適的底、蓋配對(duì)，裝入金屬盒內(nèi)或用報(bào)紙5～8個(gè)一摞包成一包。（2）試管、三角燒瓶等于開口處塞上大小適合的棉塞或紗布塞（也可用各種型號(hào)的軟木塞、膠塞等），并在棉塞、瓶口之外，包以牛皮紙，用細(xì)繩扎緊即可。制作棉塞時(shí)，要求棉花緊貼玻璃壁，沒有皺紋和縫隙，松緊適宜。過(guò)緊易擠破管口和不易塞入；過(guò)松易掉落和污染。棉塞長(zhǎng)度不小于管口直徑的2倍，約2／3塞進(jìn)管口（見圖1-1）。　　另一穗比較簡(jiǎn)單的棉塞制作方法：取一適當(dāng)大小紗布，將其中心鋪于管口任其自然下垂至管外壁，將試管上端與紗布一并握住，用一小木棒將紗布中心向管內(nèi)推進(jìn)，至該棉塞所需長(zhǎng)度后握緊試管上端，用木棒將適量棉花向管內(nèi)填塞并壓緊充實(shí)后將紗布尾端斂緊，抽出約1／3長(zhǎng)度，散開紗布將棉塞尾部加適量棉花并壓緊使之略大于試管，再斂緊尾部紗布并用棉線扎緊，剪去多余線頭紗布，一大小和松緊適宜的棉塞制作完畢（見圖1-2）。　　……

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