噬菌體展示

前言

　　將肽段和蛋白展示于絲狀噬菌體上（即噬菌體展示技術(shù)）是一種能夠?qū)⑺栊再|(zhì)的多肽從大量變異體中提取出來的體外篩選技術(shù)。從1985年GeorgeSmith最初開拓性地描述這個概念以來，噬菌體展示技術(shù)逐漸發(fā)展成為發(fā)現(xiàn)具有新功能的多肽和改變已有多肽的性質(zhì)的強大工具。噬菌體展示技術(shù)作為一種基礎(chǔ)研究工具，在蛋白質(zhì)工程和細胞生物學(xué)中應(yīng)用廣泛，包括解析蛋白功能、發(fā)現(xiàn)受體對應(yīng)的新配體和新抗體。在制藥工業(yè)和生物技術(shù)領(lǐng)域，噬菌體展示技術(shù)也深受歡迎，現(xiàn)在，由噬菌體展示技術(shù)發(fā)現(xiàn)或改造的一些蛋白和抗體已經(jīng)被批準(zhǔn)進入臨床應(yīng)用。盡管應(yīng)用很廣泛，噬菌體展示技術(shù)還是由于比較復(fù)雜且在技術(shù)上具有挑戰(zhàn)性，尚不能在大多數(shù)主流實驗室得以運用。在寫《PhageDisplay：APracticalApproach》這本書時，我們力求使它成為一本通俗易懂的實驗指南，進而使這項技術(shù)能夠在大多數(shù)研究者的研究領(lǐng)域內(nèi)得到最大范圍的應(yīng)用。目的就是為了使它無論對于新手還是老手都能適用。對于剛?cè)胄械难芯空?，關(guān)鍵性的概念和實驗步驟在本書中均有詳細的描述，章節(jié)中也含有與實驗設(shè)計相關(guān)的足夠信息，并且很多情況下都有排難解疑的內(nèi)容。而對于有經(jīng)驗的研究者，本書可以作為噬菌體展示技術(shù)的參考書，包括提供一些實驗步驟、替代的方案和一些新應(yīng)用的介紹等進展。本書的一個特別的目的是為了廣泛覆蓋噬菌體展示技術(shù)的兩個最為常見的應(yīng)用：肽庫和抗體庫。除了本書中幾個章節(jié)覆蓋到的這些主要的應(yīng)用外，噬菌體展示技術(shù)同時作為一項主要的蛋白質(zhì)工程工具廣泛地應(yīng)用于蛋白質(zhì)改造和優(yōu)化蛋白質(zhì)功能。另外，噬菌體展示實驗中的每個過程（無論是庫的構(gòu)建，篩選，還是對于結(jié)果的分析）都可以通過很多途徑完成。其中，篩選的過程（即使表達所需性質(zhì)的多肽或蛋白的噬菌體富集的過程）賦予了很大創(chuàng)造性的，本質(zhì)上說，只局限于研究者的想象力。我們的目標(biāo)就是為了讓讀者能夠跳出具體實驗步驟的條條框框的限制，而對實驗步驟加以改造使之能為自己感興趣的蛋白或篩選系統(tǒng)服務(wù)。基于此目的，本書以分子生物學(xué)的步驟為模式，逐步介紹了噬菌體庫的構(gòu)建、篩選和分析步驟。第1章提供了噬菌體生物學(xué)和噬菌體技術(shù)的概述，目的是讓讀者對大概的原理、實驗策略有個先期的了解，并簡單介紹了當(dāng)著手于噬菌體科研項目時應(yīng)該如何做出選擇。同時，因為提供了具體實驗步驟和方法的位置以及列出了在各階段可替代實驗方法，本章也可作為本書其余章節(jié)的導(dǎo)航工具。第2章和第3章接著描述出了兩種常見的準(zhǔn)備多樣化文庫的方案：寡核苷酸定向誘導(dǎo)突變和DNA改組。第4章提供了設(shè)計篩選過程的指導(dǎo)和實施親和篩選的實驗步驟。第5章描述了一個通過簡單的ELISA步驟，分析篩選得到的噬菌體克隆親和性（普遍最為關(guān)注的參數(shù)）的方法。接下來的各個章節(jié)主要集中在具體應(yīng)用，包括從肽庫中篩選配體（第6章），篩選酶底物肽（第7章），篩選DNA結(jié)合蛋白（第9章），通過cDNA展示克?。ǖ?2章）和構(gòu)建噬菌體抗體庫以及抗體優(yōu)化（第13章和第14章）。另外一些章節(jié)介紹了不同的篩選方法，包括穩(wěn)定性篩選（第8章）、體內(nèi)定向篩選（第10章），以及血清定向結(jié)合篩選（第11章）?？偟膩碚f，這些章節(jié)介紹了噬菌體展示技術(shù)中已建立或新興的主要應(yīng)用，并闡明了這些方法可能被應(yīng)用的范圍?？傮w而言，我們盡量避免了重復(fù)性描述那些可輕易在不同的載體或系統(tǒng)中使用的實驗方案，而是在各個章節(jié)中交叉引用共同的實驗方案（如電轉(zhuǎn)化大腸桿菌細胞）。但是，在有些情況下，還是包含了不同研究組中所使用的可替代的實驗方案，一則是為了說明實驗步驟中哪些變化是可能的，二則是為了保持作者實驗室中已建立的實驗方案的完整性。我們希望本書能夠成為對于所有有志于開發(fā)噬菌體展示技術(shù)潛能的讀者的一本有用的實驗工具書。在此，我們要感謝每個章節(jié)的作者所作出的卓越貢獻，以及他們?yōu)榇怂冻龅臅r間和精力。同時，我們還要感謝牛津大學(xué)出版社的編輯人員對本書的支持。

內(nèi)容概要

噬菌體展示技術(shù)已成為發(fā)展新特性多肽和改造已有多肽性質(zhì)的強大工具。雖然此項技術(shù)已被廣泛使用，但其仍然存在技術(shù)上的挑戰(zhàn)，同時其新的應(yīng)用和步驟也層出不窮。    本書是一本與時俱進、通俗易懂且兼容并包的噬菌體實驗設(shè)計和操作指南，對于那些在生物學(xué)研究和藥物開發(fā)中使用該項技術(shù)的讀者，具有很高的參考價值。    本書的目的是為了使研究工作者能夠設(shè)計和完成噬菌體課題中所涵蓋的各方面工作——從實驗策略的設(shè)計、噬茵體庫的構(gòu)建到篩選的實施和結(jié)果的分析。本書提供了如下內(nèi)容：    ·如何計劃一個成功的噬菌體展示實驗？    ·實驗設(shè)備和試劑列表    ·實驗步驟構(gòu)建噬菌體庫、進行親和篩選、分析所篩選克隆親和性    ·噬菌體展示常規(guī)應(yīng)用  包括從肽庫中篩選配體、構(gòu)建和使用噬菌體抗體庫以及使用cDNA庫展示進行表達克隆　　本書的一大特色：　　·在各章節(jié)中進行廣泛的交叉引用  使得讀者能夠跳出所介紹的具體實驗步驟的限制，而對實驗步驟加以改造，使之能為自己感興趣的蛋白或篩選提供系統(tǒng)的服務(wù)。

書籍目錄

第l章 噬菌體生物學(xué)及噬菌體展示簡介　1.1　簡介　1.2　絲狀噬菌體生物學(xué)  　1.2.1　簡介  　1.2.2　噬菌體顆粒的結(jié)構(gòu)  　1.2.3　感染  　1.2.4　復(fù)制 　 1.2.5　基因和基因表達 　 1.2.6  噬菌體裝配生理學(xué) 　 1.2.7  噬菌體裝配機制　1.3　噬菌體展示所使用的衣殼蛋白  　1.3.1　pⅧ蛋白    　1.3.2　pⅢ蛋白  　1.4　著手一個噬菌體展示項目  　1.4.1　展示的可行性  　1.4.2  筮菌體載體還是噬菌粒載體？    　1.4.3　多價展示還是單價展示？  　 1.4.4　輔助噬菌體  　1.4.5  籃菌體制備及定量的一般實驗方案　1.5　一個噬菌體展示項目的一般規(guī)則  　1.5.1　一個文庫的生成　  1.5.2　篩選  　  1.5.3　克隆的分析　1.6　常見的問題　  1.6.1　文庫的質(zhì)量　  1.6.2　表達的編輯　  1.6.3　過度篩選　1.7　作為替代的展示系統(tǒng)　1.8  筮菌體展示文庫及試劑盒的商業(yè)來源　參考文獻第2章　使用寡核苷酸定向誘變構(gòu)建噬茵體展示文庫  2.1　簡介  2.2　文庫設(shè)計的考慮    2.2.1　點突變   　 2.2.2　簡并密碼子的設(shè)計　  2.2.3　理論的和實際的多樣性　2.3　定點誘變　  2.3.1　定點誘變與盒式誘變的比較　  2.3.2　寡核苷酸定向誘變的化學(xué)和生物學(xué)　  2.3.3　無活性模板的構(gòu)建　2.4　文庫的構(gòu)建和保存　  2.4.1　單鏈DNA模板的制備　  2.4.2　異源雙鏈CCC—dsDNA的體外合成　  2.4.3　大腸桿菌的電轉(zhuǎn)化和文庫噬菌體的制備　  2.4.4　文庫的保存和再感染　2.5　生物試劑　參考文獻第3章　體外DNA重組  3.1　導(dǎo)言  3.2　體外DNA重組的本底    3.2.1　體外DNA重組在定向進化中的使用    3.2.2　體外DNA重組的應(yīng)用    3.2.3　重組統(tǒng)計學(xué)  3.3　體外DNA重組的方法    3.3.1　Stemmer法    3.3.2  來自大腸桿菌的內(nèi)切核酸酶V的DNA的隨機片段化    3.3.3　隨機引物重組    3.3.4　交錯延伸程序    3.3.5　體外異源雙鏈的形成和體內(nèi)修復(fù)（異源雙鏈重組）    3.3.6　重組方法的選擇    3.3.7　本底的消除    3.3.8　技術(shù)要點  參考文獻第4章  為提高蛋白及多肽的親和性及特異性的噬菌體篩選策略  4.1　簡介  4.2　載體的考慮    4.2.1　單價和多價噬菌體展示    4.2.2　確保展示的成功    4.2.3　通過噬菌粒載體的蛋白質(zhì)表達    4.2.4　載體的構(gòu)建及噬菌粒的制備  4.3　文庫的設(shè)計    4.3.1　硬隨機突變    4.3.2　軟隨機突變  4.4　靶標(biāo)的呈遞　　……　　第5章　用噬菌體ELISA快速鑒定噬菌體展示蛋白的結(jié)合親和性第6章　使用重組肽庫為受體識別新配體第7章　底物噬菌體展示第8章　從噬菌體展示文庫中對穩(wěn)定折疊的蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域進行的基于蛋白酶的篩選第9章　鋅指結(jié)構(gòu)與其他核酸結(jié)合性基序的噬菌體展示第10章　噬菌體展示文庫在體內(nèi)及體外的篩選第11章　利用血清篩選噬菌體文庫第12章　使用展示在噬菌體上的cDNA文庫進行相互作用克隆第13章　噬菌體抗體文庫第14章　噬菌體抗體的親和力成熟附錄　普通供應(yīng)商

章節(jié)摘錄

　　第l章 噬菌體生物學(xué)及噬菌體展示簡介　　1.1　簡介　　在絲狀噬菌體上展示多肽和蛋白質(zhì)——噬菌體展示技術(shù)——是一種能夠?qū)⑺栊再|(zhì)的多肽從含有大量變異體的集落中提取出來的體外篩選技術(shù)。通過將所感興趣的基因融合到噬菌體衣殼蛋白基因中，可以使噬菌體顆粒展示該基因編碼的蛋白，同時噬菌體顆粒中包含了該基因，從而提供了表型與基因型的直接聯(lián)系。這種聯(lián)系使得噬菌體庫可以經(jīng)過一輪篩選步驟（例如親和層析），然后通過測序鑒定所得到的克隆，并可以通過再擴增以進行更多輪的篩選。自從mith[1]首次闡述該方法以來，噬菌體展示技術(shù)已經(jīng)發(fā)展成為了一種發(fā)現(xiàn)新特性多肽以及改變已有多肽性質(zhì)的強大工具（見參考文獻〔2～5〕的綜述部分）。絲狀噬菌體在用作克隆載體尤其用于展示載體的很多方面都非常理想：絲狀噬菌體的基因組比較小并且允許插入外源片段到非必要區(qū)域中；庫的克隆和擴增也因為能夠同時分離單鏈和雙鏈DNA和可利用簡單的基于質(zhì)粒的載體而易于進行；衣殼蛋白能夠在被修改的同時保留感染能力；噬菌體可以被富集到較高滴度，因為其增殖不會破壞宿主細胞；噬菌體顆粒在可能的篩選條件下的較寬范圍內(nèi)能夠保持穩(wěn)定。本章節(jié)的意圖是為在開始噬菌體展示實驗項目的提供所需的一些基本知識。在最開始的部分中，主要是總結(jié)性地介紹噬菌體地生活周期、遺傳學(xué)以及結(jié)構(gòu)生物學(xué)，其中重點介紹的是與噬菌體展示相關(guān)的方面。接下來，我們將介紹在接觸一個新的噬菌體展示實驗項目時所需要考慮的一些基本問題，包括展示形式的選擇，實驗設(shè)計和通常遇到的困難。最后，為了使研究者能夠有預(yù)先的準(zhǔn)備，我們提供了噬菌體載體、試劑盒以及其他展示系統(tǒng)的商品來源。我們也提供了包含詳細實驗步驟的章節(jié)間的前后對照。

編輯推薦

　　如何計劃一個成功的噬菌體展示和實驗？噬菌體展示實驗所需設(shè)備和試劑列表，實驗步驟，構(gòu)建噬菌體庫，進行親和篩選，分析所篩選克隆親和性噬菌體展示常規(guī)常用。

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