現(xiàn)代分子生物學(xué)實驗

前言

　　序言　　多年的分子生物學(xué)教學(xué)與科研工作使我深刻認(rèn)識到實驗技術(shù)在這門學(xué)科中的重要地位。跟其他的生物學(xué)學(xué)科一樣，分子生物學(xué)也是一門實驗學(xué)科，任何理論上的突破都必須建立在堅實的實驗基礎(chǔ)上，所以對于任何一位希望真正掌握分子生物學(xué)這門學(xué)科的人來說，都需要在學(xué)習(xí)分子生物學(xué)基礎(chǔ)理論的同時，熟悉和掌握分子生物學(xué)的基本實驗技術(shù)?！　嶋H上隨著科學(xué)技術(shù)的普遍發(fā)展，生物學(xué)的各個分支學(xué)科，無論是傳統(tǒng)的植物學(xué)、動物學(xué)、生理學(xué)、遺傳學(xué)，還是新興的生物化學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)；無論是宏觀的生態(tài)學(xué)、進(jìn)化生物學(xué)，還是微觀的微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)的研究，都已經(jīng)深入到分子水平，與其說分子生物學(xué)是生物學(xué)的一個新興學(xué)科，不如說分子生物學(xué)是生物學(xué)各學(xué)科共同的基礎(chǔ)，是生物學(xué)研究的一種先進(jìn)的理念和手段。正因為意識到這一點，現(xiàn)在分子生物學(xué)已經(jīng)成為生物學(xué)一級學(xué)科所有學(xué)生必須掌握的一門基礎(chǔ)核心課程。　　更進(jìn)一步說，分子生物學(xué)也與生命科學(xué)領(lǐng)域的其他相關(guān)學(xué)科，如醫(yī)學(xué)、農(nóng)學(xué)、林學(xué)、藥學(xué)、古生物學(xué)等密切相關(guān)，甚至化學(xué)、環(huán)境科學(xué)、物理學(xué)、地質(zhì)學(xué)等學(xué)科也開辟了利用分子生物學(xué)理論與技術(shù)研究自身學(xué)科科學(xué)問題的方向，出現(xiàn)了化學(xué)生物學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)、生物物理學(xué)、地質(zhì)生物學(xué)等交叉學(xué)科，越來越多的專業(yè)人員需要分子生物學(xué)的專業(yè)知識，越來越多的專業(yè)人員希望熟悉和掌握相關(guān)的分子生物學(xué)實驗技術(shù)，因此綜合性院校、農(nóng)林醫(yī)專業(yè)院校等均開設(shè)了分子生物學(xué)課程，選修人數(shù)相當(dāng)可觀。

內(nèi)容概要

　　《現(xiàn)代分子生物學(xué)實驗》的編寫注重實用性和創(chuàng)新性統(tǒng)一，在實驗內(nèi)容的編排上不再按照“基礎(chǔ)實驗+綜合實驗”的基本模式，而是依據(jù)分子生物學(xué)研究的自身特點和一般流程，分為特定基因的克隆、克隆基因的表達(dá)和表達(dá)產(chǎn)物的純化、特定基因的功能研究、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用、DNA與蛋白質(zhì)的相互作用5個部分。每部分整合若干實用的分子生物學(xué)研究技術(shù)，使讀者對每一個實驗的目的和適用領(lǐng)域更加明確，也便于快速地選擇相關(guān)實驗技術(shù)參考借鑒?！冬F(xiàn)代分子生物學(xué)實驗》除了分子生物學(xué)最為基礎(chǔ)的實驗技術(shù)外，也涵蓋了目前比較先進(jìn)的研究技術(shù)和研究方法，如RNA干擾、實時熒光定量PCR、流式細(xì)胞儀分析、熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)等。在每個實驗中，都特別強(qiáng)調(diào)操作的注意事項和實驗取得成功的關(guān)鍵，注重實用性?！冬F(xiàn)代分子生物學(xué)實驗》適合作為高等院校生命科學(xué)類及相關(guān)專業(yè)分子生物學(xué)實驗課程的教材使用，也可供相關(guān)科研及實驗技術(shù)人員參考。

書籍目錄

第1章  特定基因的克隆附1.1  Bad基因介紹實驗1.1  從核酸數(shù)據(jù)庫中獲得mBad基因編碼序列實驗1.2  從細(xì)胞中提取總RNA實驗1.3  逆轉(zhuǎn)錄獲得小鼠B16F10細(xì)胞的cDNA實驗1.4  PCR擴(kuò)增目的基因mBad附1.2  mBad基因PCR引物的設(shè)計實驗1.5  PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳回收實驗1.6  SDS堿裂解法提取質(zhì)粒DNA實驗1.7  用質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒制備質(zhì)粒DNA附1.3  克隆載體的選擇實驗1.8  DNA的限制性酶切和酶切產(chǎn)物的回收附1.4  酶切位點的選擇實驗1.9  連接附1.5  平端DNA的連接反應(yīng)實驗1.10  轉(zhuǎn)化實驗1.11  陽性重組子的篩選以及測序驗證第2章  克隆基因的表達(dá)和表達(dá)產(chǎn)物的純化實驗2.1  His-tag EGFP在大腸桿茵中的表達(dá)和純化附2.1  融合蛋白表達(dá)載體pHis-EGFP的構(gòu)建及融合蛋白的親和純化結(jié)果實驗2.2  GST-EBFP融合蛋白在大腸桿茵中的表達(dá)和純化附2.2  GST-EBFP的純化結(jié)果實驗2.3  GST-EBFP在巴氏畢赤酵母中的表達(dá)附2.3  pPICZ C-GST-EBFP重組質(zhì)粒的構(gòu)建、鑒定實驗2.4  GST-EGFP在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)純化附2.4  重組AcNPV-EGFP病毒的構(gòu)建與篩選第3章  特定基因的功能研究實驗3.1  用重疊延伸PCR法進(jìn)行EGFP基因的定點突變附3.1  重疊延伸PCR法基因定點突變的實驗結(jié)果實驗3.2  用單管大引物PCR法進(jìn)行EGFP基因的快速定點突變附3.2  單管大引物PCR法基因定點突變的實驗結(jié)果實驗3.3  mBad基因在293T細(xì)胞中的瞬時表達(dá)實驗3.4  western b10tting檢測瞬時轉(zhuǎn)染基因的表達(dá)實驗3.5  人DNMT1基因干擾質(zhì)粒shRNA真核表達(dá)載體的構(gòu)建附3.3  干擾質(zhì)粒的設(shè)計實驗3.6  質(zhì)粒DNA的大量純化實驗3.7  脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞MCF-7附3.4  質(zhì)粒轉(zhuǎn)染結(jié)果實驗3.8  實時熒光定量PCR法檢測DNMT1基因mRNA表達(dá)水平附3.5  熒光定量PCR實驗結(jié)果實驗3.9  利用熒光顯微鏡檢測細(xì)胞骨架蛋白β-actin在A549細(xì)胞中的定位附3.6  A549細(xì)胞中β-actin的熒光顯微鏡照片實驗3.10  流式細(xì)胞儀檢測紫杉醇對A549細(xì)胞周期的影響附3.7  紫杉醇處理對A549細(xì)胞周期的影響實驗3.11  流式細(xì)胞儀檢測臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖附3.8  流式細(xì)胞儀檢測臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖實驗3.12  流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡附3.9  流式細(xì)胞儀檢測Jurkat淋巴瘤細(xì)胞的凋亡第4章  蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用實驗4.1  酵母雙雜交體系發(fā)現(xiàn)FADD與Fas的相互作用實驗4.2  二維電泳比較FADD和FADD-/-細(xì)胞株的蛋白質(zhì)表達(dá)差異附4.1  SDS-聚丙烯酰胺凝膠的經(jīng)驗配方附4.2  2DE常見問題與解決辦法實驗4.3  GST pull-down驗證FADD與Fas的相互作用附4.3  GST pull-down驗證FADD與Fas相互作用的結(jié)果示意圖實驗4.4  免疫共沉淀分析FADD與Fas相互作用的結(jié)構(gòu)域附4.4  Fas與FADD不同結(jié)構(gòu)域相互作用的Co-IP結(jié)果示意圖實驗4.5  熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)（FRET）分析FADD與Fas相互作用實驗4.6  利用噬茵體肽庫展示技術(shù)篩選與鏈霉親和素特異性結(jié)合的氨基酸序列第5章  DNA與蛋白質(zhì)的相互作用實驗5.1  EMSA分析轉(zhuǎn)錄因子NF-kB與DNA結(jié)合序列的結(jié)合實驗5.2  染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）分析NF-kB與TRAF1基因啟動子序列的結(jié)合實驗5.3  報告基因檢測技術(shù)分析不同細(xì)胞中PSM_A基因的啟動子活性附錄Ⅰ  網(wǎng)絡(luò)資源附錄Ⅱ  常用儀器及供應(yīng)商附錄Ⅲ  著名生物試劑公司及其特色產(chǎn)品附錄Ⅳ  常用溶液配制附錄Ⅴ  常用工具酶附錄Ⅵ  實驗室常用技術(shù)參數(shù)資料

章節(jié)摘錄

　　首先需要從核酸數(shù)據(jù)庫中檢索目的基因序列，根據(jù)不同情況通過化學(xué)合成、從基因組分離或者從mRNA逆轉(zhuǎn)錄獲得目的基因片段，然后根據(jù)克隆要求設(shè)計PCR引物，再通過PCR擴(kuò)增目的基因片段。　　化學(xué)合成法比較適合于合成較短的目的基因。隨著合成技術(shù)的不斷進(jìn)步，化學(xué)合成DNA的成本越來越低，合成的速率越來越快，長度也越來越長，但是仍然存在合成長度的限制。而如果需要根據(jù)工程菌的密碼子偏愛性對目的基因的密碼子進(jìn)行優(yōu)化，化學(xué)合成法則是唯一可行的方法?！　τ跊]有內(nèi)含子的真核基因，以及結(jié)構(gòu)比較簡單的原核基因，可以用基因組DNA為材料直接獲取目的基因的編碼片段?！　∮捎诮^大部分真核基因中存在復(fù)雜的內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，因此只能以基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，通過逆轉(zhuǎn)錄獲取編碼目的基因的DNA片段。逆轉(zhuǎn)錄與PCR偶聯(lián)的RT-PCR技術(shù)是獲得基因克隆所需的目的基因片段的最常用手段?！　《?、載體的選擇有很多商業(yè)化的載體可供選擇。用于基因克隆的載體必須具備3個基本條件：具有自主復(fù)制能力、帶有多克隆位點以及可用做篩選標(biāo)記的抗性基因?！　∪⑾拗菩悦盖杏每梢宰R別和切割特異性DNA序列的限制性酶切割載體和目的DNA片段，產(chǎn)生對合的黏端，使目的DNA片段可以插入到載體中。　　……

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