生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)

前言

《生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》一書是教學(xué)改革的成果，書中每個(gè)實(shí)驗(yàn)之間都有著非常緊密的聯(lián)系，改變了以前分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)之間割裂無(wú)聯(lián)系的狀況，這樣的嘗試尚屬首次。根據(jù)科學(xué)研究的順序一般情況下首先得到一個(gè)有意義的基因；其次是克隆重組此基因；再經(jīng)鑒定后進(jìn)行基因表達(dá)；后續(xù)分離純化屬于生物化學(xué)部分，因此本書在編排順序上將分子生物學(xué)實(shí)瞼排在前，生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)排在后，保持學(xué)科的完整性和連貫性。本書以綠色熒光蛋白基因?yàn)橹骶€貫穿整個(gè)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，綠色熒光蛋白（GFP）由于其發(fā)熒光的特性，在細(xì)胞學(xué)上有著很廣泛的應(yīng)用。一般用于目的蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位。做法是將GFP與目標(biāo)蛋白融合表達(dá)，然后用光學(xué)顯微鏡觀察熒光。本書中實(shí)驗(yàn)將真核細(xì)胞載體的綠色熒光蛋白基因在原核細(xì)胞中進(jìn)行克隆與表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物用眼睛直接觀察或者在長(zhǎng)波紫外線（485nm）激發(fā)下發(fā)出綠色熒光，是教學(xué)中基因表達(dá)非常簡(jiǎn)便的標(biāo)記物和監(jiān)測(cè)方法。書中設(shè)計(jì)了14個(gè)都與綠色熒光蛋白基因有關(guān)的實(shí)驗(yàn)，涵蓋了分子生物學(xué)的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)。另外，書中所設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)隨著實(shí)驗(yàn)編排的順序難度逐漸加大，這樣給不同層次，不同要求的學(xué)生提供選擇的余地。其中有些實(shí)驗(yàn)題目能獨(dú)立成為一。個(gè)小課題，如果在實(shí)驗(yàn)前給定實(shí)驗(yàn)題目，要求學(xué)生查閱有關(guān)資料，閱讀有關(guān)文獻(xiàn)，自己設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案，獨(dú)立完成實(shí)驗(yàn)題目，這樣對(duì)學(xué)生科學(xué)研究的思維有很大幫助。在實(shí)驗(yàn)討論部分，編入了學(xué)生的感想和對(duì)實(shí)驗(yàn)的改進(jìn)意見(jiàn)，這些設(shè)計(jì)思想和實(shí)驗(yàn)方法還有待驗(yàn)證，但是充分調(diào)動(dòng)學(xué)生學(xué)習(xí)積極性將會(huì)有益于能力的培養(yǎng)。生物化學(xué)部分編寫了常用的電泳技術(shù)，親和色譜技術(shù)，免疫學(xué)方面的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。其中親和色譜技術(shù)包含胰蛋白酶的分離純化和酶促動(dòng)力學(xué)的研究。所設(shè)計(jì)的雙向電泳，是當(dāng)前蛋白質(zhì)組學(xué)重要的不可缺少的實(shí)驗(yàn)技術(shù)之一。由于采用了組內(nèi)協(xié)作、組間討論的實(shí)驗(yàn)方式，學(xué)生之間不同學(xué)科背景的經(jīng)驗(yàn)得以相互交流，取長(zhǎng)補(bǔ)短，擴(kuò)大了知識(shí)面，培養(yǎng)了互相學(xué)習(xí)合作的精神并且增強(qiáng)了同學(xué)問(wèn)的科研氣氛，增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)的探索性和趣味性。本書有四方面的特點(diǎn)：1.實(shí)驗(yàn)題目和實(shí)驗(yàn)方法出于科學(xué)研究的最新方法，具有前瞻性。2.每個(gè)實(shí)驗(yàn)都是教師們認(rèn)真研究，思考和反復(fù)驗(yàn)證并且有明確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)本身比較成熟，學(xué)生經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練可為后續(xù)順利完成本科論文打下基礎(chǔ)。3.學(xué)生所做的實(shí)驗(yàn)均屬精選出的有特色，綜合性很強(qiáng)的實(shí)驗(yàn)，從而拓寬了知識(shí)面，掌握的技術(shù)更加全面，學(xué)生今后無(wú)論是繼續(xù)提高或者到國(guó)外深造都有較寬的選擇余地，實(shí)現(xiàn)本科教育與科學(xué)研究階段的研究生教育接軌。

內(nèi)容概要

　　《生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》分為分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)及生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)兩部分，共沒(méi)計(jì)了24個(gè)綜合性較強(qiáng)的實(shí)驗(yàn)，其中14個(gè)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)以應(yīng)用廣泛的綠色熒光蛋白基因?yàn)橹骶€貫穿，涵蓋了分子生物學(xué)的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)，包括原核生物細(xì)胞轉(zhuǎn)化。質(zhì)粒DNA的分離純化，限制性內(nèi)切酶對(duì)質(zhì)粒DNA的酶切與瓊脂糖凝膠電泳鑒定，重組技術(shù)，PCR基因擴(kuò)增，基因突變技術(shù)，蛋白質(zhì)電泳分離表達(dá)蛋白，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移技術(shù)，蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)等。10個(gè)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)涉及常用的電泳技術(shù)、親和色譜技術(shù)和免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)?！渡锘瘜W(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》作為普通高等教育“十一五”國(guó)家級(jí)規(guī)劃教材，是北京大學(xué)多年實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革的成果，充分體現(xiàn)了實(shí)驗(yàn)內(nèi)容的綜合性。通過(guò)學(xué)習(xí)和訓(xùn)練，學(xué)生們?cè)趧?chuàng)新性思維和科研動(dòng)手能力上都會(huì)得到很大提高，適合高等院校生命科學(xué)類專業(yè)本科生和研究生使用。

書籍目錄

第一部分 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)背景資料實(shí)驗(yàn)1 綠色熒光蛋白(GFP)基因轉(zhuǎn)入原核細(xì)胞 實(shí)驗(yàn)2 目的基因載體的分離純化與質(zhì)量測(cè)定 實(shí)驗(yàn)3 含綠色熒光蛋白基因載體的酶切與電泳鑒定 實(shí)驗(yàn)4 增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因表達(dá)載體的構(gòu)建 實(shí)驗(yàn)5 綠色熒光蛋白基因的表達(dá)與鑒定 實(shí)驗(yàn)6 PCR體外擴(kuò)增綠色熒光蛋白基因及其克隆與表達(dá) 實(shí)驗(yàn)7 紅色熒光蛋白、黃色熒光蛋白基因的克隆和在大腸桿菌中的表達(dá)實(shí)驗(yàn)8 谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶一綠色熒光蛋白融合蛋白的基因克隆及其表達(dá)實(shí)驗(yàn)9 增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的定點(diǎn)突變及表達(dá)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)10 攜帶增強(qiáng)型綠色熒光蛋白報(bào)告基因的溫度敏感型表達(dá)載體的構(gòu)建、鑒定和表達(dá)量的測(cè)定 附錄10－1：pBV220全序列(從ZCoRI酶切位點(diǎn)第一個(gè)A開(kāi)始) 附錄10－2：EGFP基因全序列實(shí)驗(yàn)11 雙報(bào)告基因系統(tǒng)的構(gòu)建及初步檢測(cè) 附錄11－1：L、aciferase基因全序列 附錄11－2：螢光素酶檢測(cè)步驟 實(shí)驗(yàn)12 以綠色熒光蛋白(GFP)為報(bào)告基因構(gòu)建重組酵母檢測(cè)環(huán)境中雌二醇的含量實(shí)驗(yàn)13 綠色熒光蛋白的分離、純化及其鑒定實(shí)驗(yàn)14 谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶與綠色熒光蛋白融合蛋白的分離、純化和酶學(xué)的測(cè)定附錄Ⅰ 第二部分 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)電泳技術(shù)實(shí)驗(yàn)15 SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳實(shí)驗(yàn)16 聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳 實(shí)驗(yàn)17 聚丙烯酰胺凝膠雙向電泳親和色譜技術(shù)實(shí)驗(yàn)18 雞卵黏蛋白的分離純化 實(shí)驗(yàn)19 胰蛋白酶粗提取與活性測(cè)定 實(shí)驗(yàn)20 親和色譜分離胰蛋白酶 實(shí)驗(yàn)21 胰蛋白酶動(dòng)力學(xué)測(cè)定免疫學(xué)技術(shù)實(shí)驗(yàn)22 抗血清的制備 實(shí)驗(yàn)23 抗血清抗體的測(cè)定 實(shí)驗(yàn)24 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定 附錄Ⅱ

章節(jié)摘錄

插圖：聚丙烯酰胺凝膠雙向電泳技術(shù)，大多數(shù)是以聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳為第一向，SDS一聚丙烯酰胺凝膠電泳為第二向.樣品首先是根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)差異經(jīng)過(guò)等電聚焦電泳進(jìn)行分離，然后再根據(jù)蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的差異進(jìn)行SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。但是也有時(shí)先采用相對(duì)分子質(zhì)量分離，然后再進(jìn)行等電聚焦分離。通過(guò)雙向電泳分離的蛋白質(zhì)可以同時(shí)得到等電點(diǎn)和相對(duì)分子質(zhì)量?jī)蓚€(gè)參數(shù)。分離后的電泳圖譜不是一般的電泳條帶，而是圓點(diǎn)。這是目前所有電泳分離技術(shù)中分辨率最高的一種方法。一個(gè)蛋白質(zhì)分子同時(shí)具有相對(duì)分子質(zhì)量和等電點(diǎn)兩種性質(zhì)，利用蛋白質(zhì)分子之間相對(duì)分子質(zhì)量的差異可以將不同相對(duì)分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)分開(kāi)，利用等電點(diǎn)的區(qū)別可以將不同等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)分開(kāi)。因此，聚丙烯酰胺凝膠雙向電泳技術(shù)不僅能將相對(duì)分子量和等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)分開(kāi)，而且還能將相對(duì)分子質(zhì)量相同、等電點(diǎn)不同或者等電點(diǎn)相同、相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分開(kāi)，這就大大提高了聚丙烯酰胺凝膠雙向電泳技術(shù)的分辨率。一般情況下，細(xì)胞內(nèi)同時(shí)存在等電點(diǎn)相同、相對(duì)分子質(zhì)量也相同的蛋白質(zhì)概率是非常小。所以，雙向電泳得到的蛋白質(zhì)組分絕大部分都是單一組分。在一支毛細(xì)管內(nèi)注入含載體兩性電解質(zhì)的丙烯酰胺凝膠溶液，凝膠溶液聚合以后，進(jìn)行等電聚焦分離，聚焦分離后的凝膠放在SDS－凝膠電泳的緩沖液中平衡一段時(shí)間，然后轉(zhuǎn)移到SDS－凝膠上拼接整齊，通過(guò)1％的離子瓊脂“焊接”包埋在瓊脂中，再進(jìn)行第二向電泳。被分離樣品首先在x軸橫坐標(biāo)方向?qū)⒉煌入婞c(diǎn)的蛋白質(zhì)通過(guò)等電聚焦電泳把它們分離開(kāi)，獲得了按等電點(diǎn)差異分離的蛋白質(zhì)組分。

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《生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》由高等教育出版社出版。

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