細胞生物學實驗技術

內容概要

細胞生物學實驗技術是生命科學工作者必備的知識和技術?！都毎飳W實驗技術》編寫內容由淺入深，既注重了對從事生命科學研究新手的基礎實驗技術培養(yǎng)，又介紹了近年來所發(fā)展的高新技術。每項技術都列出了基本原理、實驗準備、實驗步驟、結果分析、注意事項等條目，便于教學和學生自學?！都毎飳W實驗技術》共分7章：第一章緒論；第二章介紹組織培養(yǎng)的知識與技術基礎；第三章介紹細胞形態(tài)結構觀察技術；第四章介紹細胞內化學組分測定分析技術；第五章介紹細胞生命現象研究技術；第六章介紹細胞工程技術；第七章介紹最常用的細胞分子生物學技術。
《細胞生物學實驗技術》系統(tǒng)地介紹了細胞生物學實驗技術體系，側重對實驗技能的培養(yǎng)，是一本從事生命科學研究的實驗技術工具書，適合高等醫(yī)藥院校從事生命科學研究的研究生和工作者使用。

作者簡介

呂冬霞、羅佳濱、侯霞、張金波

書籍目錄

前言第一章 緒論第二章 組織培養(yǎng)的知識與技術基礎第一節(jié) 組織培養(yǎng)的知識基礎第二節(jié) 組織培養(yǎng)的技術基礎第三章 細胞形態(tài)結構觀察技術第一節(jié) 光學顯微鏡技術第二節(jié) 激光掃描共聚焦顯微鏡技術第三節(jié) 電子顯微鏡技術第四節(jié) 細胞形態(tài)結構觀察樣品制備技術第四章 細胞內化學組分測定分析技術第一節(jié) 免疫組織化學技術第二節(jié) 放射自顯影術第三節(jié) 流式細胞術第四節(jié) 細胞器組分的分析、分離技術第五章 細胞生命現象的研究技術第一節(jié) 細胞生長增殖研究技術第二節(jié) 細胞凋亡研究技術第三節(jié) 細胞遺傳學研究技術第四節(jié) 腫瘤細胞學研究技術第五節(jié) 藥物測試的細胞模型第六節(jié) 膜片鉗術第六章 細胞工程技術第一節(jié) 細胞融合技術第二節(jié) 單克隆抗體制備技術第三節(jié) 細胞拆合與顯微操作技術第四節(jié) DNA轉染技術第五節(jié) 轉基因動物技術第七章 常用細胞分子生物學技術第一節(jié) 電泳技術第二節(jié) 細胞基因組DNA提取及目的基因鑒定分析技術第三節(jié) 細胞總RNA提取及目的RNA鑒定分析技術第四節(jié) 細胞總蛋白質提取及目的蛋白鑒定分析技術第五節(jié) 生物芯片技術

章節(jié)摘錄

第一章  緒  論細胞是生命體的基本結構和功能單位。細胞生物學是以細胞為研究對象，從細胞整體、細胞超微結構和生物大分子水平上把細胞的形態(tài)結構與生理機能聯系起來研究，把細胞的生命活動與生物體整體生命活動聯系起來研究，從而揭示各種生命現象的物質本質及其規(guī)律的學科。細胞生物學是實驗科學，其理論體系的發(fā)展依賴實驗技術的進步?，F已形成的豐富的細胞生物學實驗技術體系，是生命科學工作者從事科學研究的重要工具。一、從生命科學的發(fā)展趨勢談細胞生物學從19世紀中葉以來，生命科學迅猛發(fā)展，呈現出以下發(fā)展趨勢。（一）由宏觀向微觀光學顯微鏡的發(fā)明使人類觀察到了生命體的基本結構單元――細胞。20世紀40年代，電子顯微鏡問世，對生命物質本質的研究進入細胞超微結構水平。20世紀50年代，高速離心機、電泳層析、分光光度計和分子標記等物理和化學技術方法引入生命科學研究，增強了細胞超微結構的化學組分和生物大分子的分離分析能力。20世紀70年代以來，不斷發(fā)展的基因操作技術推動了對生物大分子的結構和功能研究。上述實驗研究的成果提升了人類揭秘各種生命現象物質本質的能力，奠定了細胞生物學理論體系形成的基礎。（二）由分析到綜合人類對生命的認識，是一個由簡單到復雜的過程。對于簡單生命現象的分析研究比較容易取得成果，促進了知識的積累。而對復雜生命現象的研究，則需要綜合多方面、多層次的研究成果，經歸納、聯系、推理的過程，從而揭示復雜生命現象的本質和規(guī)律。19世紀生命科學杰出的成就之一――生物進化論，是達爾文綜合了當時的諸多學科領域的研究成果，包括生物分類學、比較解剖學、古生物學、胚胎學、細胞學等，科學地揭示了物種起源這一復雜生命現象的本質和規(guī)律?？梢哉J為，細胞與分子生物學理論體系的形成是生命科學的又一重要成就。細胞生物學不是研究單一生命現象的學科，而是綜合了在細胞超微結構水平和分子水平上對各種生命現象的現代研究成果而形成的理論體系，是生命科學的綜合性基礎學科，是進一步研究復雜生命現象，探索生命奧秘的工具學科和前沿學科。（三）由解釋生命到改造生命由于現代生命科學的發(fā)展，使人類解釋生命的能力大大增強。然而，人們更感興趣于改造生命，創(chuàng)造超自然的生物品種以及生命現象為人類所利用。在生命科學發(fā)展中，形成了細胞工程和基因工程系列理論和技術，就其內容而言，也應屬于細胞和分子生物學的組成部分。這是一個可以同生產實踐產生密切聯系的高科技領域，其派生的生物產業(yè)已經產生了巨大的經濟效益。因此，細胞生物學是生命科學基礎理論與生產實踐相結合的橋梁學科。二、細胞生物學的學科地位和研究任務細胞生物學在生命科學的各基礎分支學科中發(fā)揮紐帶和核心作用是很自然的，在生物界，無論是單細胞生物，還是多細胞生物體的一個細胞都表現出生命的本質屬性，即是一個在一定條件下能獨立生存、新陳代謝、自我調節(jié)的開放體系。生命體所表現出的一切生命現象，如新陳代謝、生長發(fā)育、遺傳變異、繁殖、應激等，都是以細胞作為基本結構和功能單位的生命活動體現。正像著名的生物學家E.B.Wison所說：“一切生物學問題的答案最終都要到細胞中去尋找。因為所有生物體都是，或曾經是一個細胞。”對細胞物質本質和細胞生命活動規(guī)律認識的發(fā)展，自然地直接推動生命科學其他分支學科的進步。細胞生物學的研究任務主要表現為兩個方面，一是為生命科學各分支學科提供理論基礎，二是在應用科學方面為生產實踐提供技術方法。細胞生物學基礎理論研究任務：①從細胞整體、細胞超微結構和生物大分子三個水平上闡明細胞的結構基礎；②對細胞表現出的生理機能和生命活動進行相關化學組分定性和結構區(qū)域定位；③探索細胞器之間，細胞與細胞之間，細胞與環(huán)境之間的聯系、影響、物質和信息交換規(guī)律；④說明細胞的生命活動與生物體整體生命活動的關系，從而揭示生物體各種生命現象的物質本質和規(guī)律。細胞生物學在應用科學研究中已發(fā)揮的主要作用：①培育具有研究價值和經濟價值的新物種。如通過細胞雜交技術培育雜種細胞株，通過基因工程技術培育基因重組細胞株，通過轉基因技術培育轉基因動物或植物。②把細胞生物學研究成果應用于人類疾病的診斷和防治。如應用單克隆抗體技術已研制推廣了數百種疾病的診斷試劑盒，使疾病的診斷工作簡便而精確；應用組織工程技術已成功地在體外培養(yǎng)了組織工程皮膚、結締組織、血管、腸管等，用于臨床治療；干細胞技術是近年來新興的研究領域，目前已能在體外以干細胞為種子，培育人類的多種組織和器官的細胞，來代替病變或衰老的組織細胞，用于疾病的防治；應用克隆人類胚胎技術，從患者的克隆胚胎取材，用于組織器官移植，替代患者的病變組織器官，可降低免疫排斥的風險。③研制生物藥劑和其他生物產品。如應用細胞工程和基因工程技術已可以大量生產純度很高的蛋白質制劑，有各種抗體、受體、生長因子、細胞因子、血液因子、激素肽、神經遞質等，這些產品已商品化，廣泛應用于醫(yī)學診斷和治療實踐?；蚪M學和蛋白質組學研究的快速進展，必將促進生物制劑產業(yè)更快地發(fā)展，取得更大的經濟效益。三、細胞生物學的實驗技術體系細胞生物學的發(fā)展對實驗技術的發(fā)展有很大的依賴性。細胞生物學以其豐碩的研究成果當之無愧地成為生命科學的核心基礎學科和前沿學科，同時也形成了一套豐富的、有廣泛應用價值的實驗技術體系。細胞生物學實驗技術體系可以大致歸納成以下幾個方面。（一）細胞離體培養(yǎng)技術細胞生物的幾乎所有組織細胞都可作為細胞離體培養(yǎng)的材料。針對不同的細胞培養(yǎng)對象，已形成了豐富多樣的培養(yǎng)方法，積累了豐富的經驗。細胞離體培養(yǎng)技術在生命科學基礎理論研究和應用科學研究中是應用極廣泛的基礎技術，在分子生物學研究和細胞工程及基因工程高科技領域也是不可或缺的技術基礎。（二）細胞形態(tài)結構觀察技術細胞顯微結構觀察，主要體現于各種光學顯微鏡技術，包括復式顯微鏡、倒置顯微鏡、暗視野顯微鏡、相差顯微鏡、熒光顯微鏡等。細胞超微結構觀察主要依靠X射線衍射儀和電子顯微鏡技術。觀察方式分為活體細胞觀察、細胞固定染色觀察和組織切片固定染色觀察。記錄觀察結果可采用靜態(tài)顯微攝影和動態(tài)顯微拍攝電影術。（三）細胞亞顯微結構和化學組分分離分析測定技術細胞中的某些細胞器、亞細胞組分和生物大分子的分離主要靠高速離心和差速離心技術，配合相應的提取純化方法。一些生物大分子組分，如DNA、RNA、蛋白質、酶類、脂類、糖類，可依據研究需要，選用細胞分化染色技術、免疫組織化學技術、分子標記及放射自顯影技術、分光光度技術、流式細胞術等。上述技術是研究細胞的結構與功能的關系，或判定評價細胞的功能狀態(tài)的重要手段。（四）細胞各種生命現象的研究技術生物體的一切生命現象都是其物質構成的基本單元――細胞的生命活動體現。研究細胞生命活動的規(guī)律，對揭示生物體整體生命現象的物質本質和規(guī)律具有重要意義。這方面已積累了豐富的研究方法和技術，如細胞增殖和細胞周期研究技術、細胞凋亡研究技術、細胞遺傳研究技術、細胞免疫研究技術、細胞信號傳導研究技術、細胞代謝研究技術和腫瘤細胞研究技術等。（五）細胞工程技術所謂細胞工程即按研究者的意愿，運用細胞生物學和分子生物學技術改造細胞的結構和性狀，使之滿足科學研究和生產實踐的需要。如人工誘變培育突變細胞株技術；經細胞雜交，篩選雜種細胞株技術；經細胞拆合、細胞核質雜交，獲得克隆動物技術；DNA轉染獲得基因重組細胞株技術；轉基因動物技術等。（六）細胞分子生物學技術細胞生物學研究的深入，必然進入生物大分子水平。對基因及其產物蛋白質的功能驗證，最終要到細胞中去尋找答案。細胞生物學和分子生物學的研究目標任務及方法技術自然趨于融合。這個技術領域包括：①細胞基因組DNA提取、純化、定量分析技術；目的基因鑒定，即探針與DNA分子雜交技術；目的基因的克隆擴增及表達技術；基因芯片技術；目的基因結構分析技術，包括PCR、RFLP、SSCP、AFLP和DNA測序等技術；基因敲除技術等。②細胞總RNA提取、純化、定量分析技術；目的RNA的鑒定，即探針與RNA分子雜交，分別有斑點印跡雜交、Northern blotting印跡雜交和RT-PCR技術，可定量分析目的RNA的表達量。③細胞總蛋白質提取、純化、定量分析技術；目的蛋白質的鑒定，即蛋白質分子雜交，分別有免疫組織化學技術和Western boltting雜交技術，可定量分析目的蛋白質的表達水平；目的蛋白質的結構分析技術，有氨基酸序列測定和蛋白質結構的生物化學分析方法。（羅佳濱  呂冬霞）參考文獻鄂征．2001.組織培養(yǎng)和分子細胞學技術．北京：北京出版社王培林．2005.醫(yī)學細胞生物學．北京：人民衛(wèi)生出版社章靜波．2002.組織和細胞培養(yǎng)技術．北京：人民衛(wèi)生出版社第二章  組織培養(yǎng)的知識與技術基礎第一節(jié)  組織培養(yǎng)的知識基礎一、組織培養(yǎng)的概念及技術評價組織培養(yǎng)（tissue culture）指的是從體內取出組織，在體外模擬體內生理環(huán)境，在無菌、適當溫度和一定營養(yǎng)條件下，使之生存和生長并維持其結構和功能的方法。細胞培養(yǎng)（cellculture）用的也是同樣的方法，培養(yǎng)物是單個細胞或細胞群。在培養(yǎng)組織過程中，現代的培養(yǎng)技術尚不能在體外維持組織的結構和機能長期不變，因此在進行培養(yǎng)時，不論培養(yǎng)物是組織或細胞都要生活在人工環(huán)境中。生存環(huán)境的改變，細胞的移動（運動）、培養(yǎng)時間過長特別是反復傳代，很容易導致細胞發(fā)生變動或出現單一化現象，即趨向于變成單一類型細胞，最終也變成了細胞培養(yǎng)。另外所謂細胞培養(yǎng)，也并不意味細胞彼此是獨立的。細胞在培養(yǎng)中的生命活動和在體內時一樣，仍然是相互依存的，呈現著一定“組織”特性。所以，組織培養(yǎng)和細胞培養(yǎng)并無嚴格區(qū)別。因此在本書的敘述中，這兩個詞將作為同義語使用。所謂器官培養(yǎng)（organ culture），指的是應用與組織培養(yǎng)相似的條件，培養(yǎng)的是器官的原基、器官的一部分或整個器官，使之在體外生存、生長和保持一定功能的方法。以上三個層次的培養(yǎng)，又可統(tǒng)稱之為體外培養(yǎng)（invitro）。組織培養(yǎng)不僅是一種技術，也是一門科學。從廣義上說組織培養(yǎng)分為動物組織培養(yǎng)和植物組織培養(yǎng)兩大類，本書主要敘述動物特別是人體組織培養(yǎng)。被用于組織培養(yǎng)的細胞或組織是非常好的實驗對象。組織培養(yǎng)在現代醫(yī)學和生物科學研究中應用極為廣泛，這與其有一系列優(yōu)點是分不開的。（1）能長時間直接觀察活細胞的形態(tài)結構和生命活動，可用于細胞學、遺傳學、免疫學、實驗醫(yī)學和腫瘤學等多種學科的研究工作。（2）便于使用攝影、攝電影和閉路電視等方法進行記錄，能直接觀察細胞變化。（3）可供研究的細胞種類極為廣泛，從低等生物到高等動物以及人類、從胚胎到成體、從正常組織到腫瘤細胞，皆可用于培養(yǎng)。（4）便于使用各種不同的技術方法，如相差顯微鏡、熒光顯微鏡、電子顯微鏡、組織化學、核素標記等方法觀察和研究細胞。（5）培養(yǎng)細胞攜帶有與體內細胞同等的基因組（genome），也是分子生物學和基因工程學的研究對象；細胞培養(yǎng)技術已是分子生物學和基因工程的重要組成部分。（6）易于使用物理、化學和生物因素等進行實驗研究。（7）可同時提供大量生物性狀相似的實驗對象，耗資少，比較經濟。（8）已成為生物制品、單克隆抗體生產和基因工程制品等的生產手段。組織培養(yǎng)作為一種技術仍有其局限性，主要是組織和細胞離體以后，生存在人工培養(yǎng)環(huán)境中，而人工模擬體內環(huán)境的技術還有很大差距。因此在利用培養(yǎng)細胞做實驗對象時，不應視為與體內細胞完全一樣，實驗結果不可以輕易認同為體內實驗，細胞培養(yǎng)實驗模型不能取代動物實驗和臨床實驗。二、離體培養(yǎng)細胞的生物學特點細胞在體外培養(yǎng)后，如一切條件適宜，便可生存和進行生命活動，如移動等，但最主要的是生長和增殖。生長和增殖并非同一概念，細胞生長指的是細胞體積增大，而細胞增殖是細胞數量增多。體外培養(yǎng)細胞來源于體內，其基本細胞生物學規(guī)律和體內相同，但隨生活環(huán)境的改變，很多方面如形態(tài)結構和增殖規(guī)律等，與體內時又有所差別。這里所敘述的是“體外培養(yǎng)細胞生物學”，即有關細胞體外培養(yǎng)條件下的細胞生物學行為，它具有自身的特點和規(guī)律，不能為一般細胞生物學完全替代，是組織培養(yǎng)工作者應熟知的知識。（一）離體培養(yǎng)細胞的差異和分化已如前述，目前人體內所有細胞基本上皆可進行培養(yǎng)。培養(yǎng)細胞已成為人們借以研究人體內相應器官、組織和細胞的正常和異常生命活動的重要對象。但卻面臨一個重要的問題，即體外培養(yǎng)細胞和體內細胞是否有差異，是否可視為同一。如否，則培養(yǎng)細胞將失掉其應用價值。因此這是一個十分重要和應首先闡明和回答的理論問題。比較體內、外細胞，它們的增殖方式是相同的，均為有絲分裂。體內、外細胞的差異關鍵在于細胞的分化，因此細胞分化是檢測細胞差異的核心問題。當前人工模擬體內環(huán)境的技術水平已經很高，細胞生活在人工培養(yǎng)條件下不僅能很好的生存、生長和增殖，在一定程度上，人們已能控制細胞的分化。但當前我們畢竟尚未能徹底了解人體內一切細胞活動的內在聯系，人工所模擬的條件與體內實際情況仍不完全相同。這樣，當細胞被置于體外培養(yǎng)后，一旦失去神經體液的調節(jié)和細胞相互間的影響、生活在缺乏動態(tài)平衡的環(huán)境中，最終發(fā)生變化是必然的。離體培養(yǎng)細胞在分化方面主要表現出以下特點：（1）失去原有的組織結構和細胞形態(tài)，形態(tài)上的分化減弱，趨于單一化，類似返祖現象。（2）由于生存環(huán)境的改變，細胞的外源信號來源切斷，特定基因分化表達減弱或停止，導致特定的蛋白或酶類的合成減弱或停止，進而導致細胞在體內時原有的分化功能減弱或消失。但一種分化特性的喪失，不等于徹底消除了分化能力，從細胞遺傳學角度分析，離體培養(yǎng)細胞含有與體內細胞相同的基因組。只有當特定基因的表達的減弱或停止是基因突變所致，細胞的特定去分化表現才是不可逆的。以肝細胞為例，離體肝細胞合成酪氨酸轉移酶停止，有人證明肝細胞產生酪氨酸轉移酶需要激素的誘導和與相應細胞基質的相互作用，只要這些條件存在，離體肝細胞仍可產生酪氨酸轉移酶。（3）離體細胞在一定條件下有產生不同于體內時的新的分化方向的潛能。在體內膠原蛋白是成纖維細胞和骨細胞的主要產物。而在一定條件下，離體培養(yǎng)的上皮細胞、神經細胞甚至一些腫瘤細胞也能產生膠原蛋白。（4）離體細胞仍保持在體內時在壽命上的分化。如人類成纖維細胞在適宜的條件下體外可以傳30～50代，相當于150～300個細胞周期，最后衰老死亡?！?/pre>




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