真核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控

內(nèi)容概要

真核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控：概念、策略與技術(shù)（第二版）是美國冷泉港實驗室出版社出版的《真核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控——概念、策略與技術(shù)》（第二版）一書的中譯本。書中全面介紹了真核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的概念，以及進行研究所使用的策略和技術(shù)。涉及內(nèi)容包括哺乳動物細胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控入門知識、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的兩個重要角色——DNA元件和蛋白質(zhì)組分的鑒定及功能表征，以及兩者間復(fù)雜的相互作用構(gòu)成的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的重要事件和這些事件發(fā)生的染色質(zhì)環(huán)境。
真核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控：概念、策略與技術(shù)（第二版）概括了真核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的基本概念、實施轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究的基本策略，以及實現(xiàn)研究目標的重要技術(shù)。因此，真核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控：概念、策略與技術(shù)（第二版）對于醫(yī)學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)、生物技術(shù)等領(lǐng)域中對基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控感興趣或從事相關(guān)研究的學(xué)生、教學(xué)科研人員和技術(shù)人員是一本重要讀物。

書籍目錄

譯者序前言概述縮略詞1 哺乳動物細胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控入門引言和概述全基因組方法小結(jié)染色質(zhì)和通用轉(zhuǎn)錄機器染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和組織染色質(zhì)修飾染色質(zhì)重塑通用轉(zhuǎn)錄機器調(diào)控區(qū)的組織基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的組裝和起始調(diào)解因子TFIID和TAF活化和抑制基因活化轉(zhuǎn)錄起始期間的染色質(zhì)修飾和重塑通用機器募集的一種模式聚合酶II延伸的初始階段聚合酶II在基因內(nèi)遭遇核小體轉(zhuǎn)錄的沉默或抑制結(jié)語參考文獻2 初始策略性問題引言和概述實驗策略新轉(zhuǎn)錄因子的表征方法分析新基因的調(diào)控專題2.1 核連綴轉(zhuǎn)錄分析考慮達到明確目標所需的時間投入和資源確定項目目標評估分析的可行性啟動對新基因的綜合轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析技術(shù)方案2.1 核連綴分析參考文獻3 轉(zhuǎn)錄起始位點的定位引言和概述實驗策略初步考慮快速擴增cDNA末端(RACE)專題3.1 帽子依賴性RACE程序引物延伸專題3.2 引物延伸RNase保護法專題3.3 RNase保護S1核酸酶分析專題3.4 核酸酶保護專題3.5 核酸酶保護技術(shù)方案3.1 引物延伸分析方案3.2 RNase保護分析參考文獻4 啟動子分析的功能性分析方法引言和概述實驗策略選擇分析方法:各種分析方法的優(yōu)缺點瞬時轉(zhuǎn)染分析專題4.1 常用的轉(zhuǎn)染方法專題4.2 螢光素酶報告基因分析專題4.3 CAT報告基因分析專題4.4 LacZ、SEAP和GFP報告基因分析法專題4.5 瞬時轉(zhuǎn)染細胞的分離通過染色體整合的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染分析專題4.6 有復(fù)制能力的載體技術(shù)哺乳動物細胞的常用轉(zhuǎn)染方法方案4.1 3T3成纖維細胞的磷酸鈣轉(zhuǎn)染方案4.2 淋巴細胞系的DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染方案4.3 RAW264.7巨噬細胞的電穿孔轉(zhuǎn)染方案4.1~4.3的附加說明方案4.4 螢光素酶分析方案4.5 氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶分析方案4.6 β-半乳糖苷酶分析參考文獻5 遠程控制區(qū)的鑒定和分析引言和概述專題5.1 DNase I高敏感性分析實驗策略DNase I高敏感性基質(zhì)附著區(qū)的鑒定專題5.2 鑒定MAR的方法鑒定遠程控制區(qū)的功能性方法表征遠程控制區(qū)的功能性分析方法參考文獻6 鑒定控制區(qū)內(nèi)的順式作用DNA元件引言和概述實驗策略通過綜合性突變體分析鑒定控制元件綜合性分析的策略來自綜合性突變體分析與系統(tǒng)發(fā)生分析比較的深刻見解參考文獻7 鑒定DNA結(jié)合蛋白及其基因引言和概述鑒定DNA結(jié)合蛋白的實驗策略數(shù)據(jù)庫方法用于粗制細胞裂解物的蛋白質(zhì)-DNA相互作用分析方法的發(fā)展專題7.1 假設(shè)EMSA結(jié)果克隆和鑒定編碼DNA結(jié)合蛋白基因的實驗策略專題7.2 通過蛋白質(zhì)純化克隆通過蛋白質(zhì)純化和肽序列分析進行克隆其他克隆方法參考文獻8 確認蛋白質(zhì)-DNA相互作用的功能相關(guān)性引言和概述實驗策略染色質(zhì)免疫沉淀通過基因破壞或RNA干擾的功能缺失研究體外蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物的豐度DNA結(jié)合蛋白和靶基因的相對表達模式蛋白質(zhì)結(jié)合所需核苷酸和調(diào)控元件活性所需核苷酸之間的相關(guān)性DNA結(jié)合蛋白的過量表達對報告基因或內(nèi)源基因的反式激活與相鄰控制元件結(jié)合的蛋白質(zhì)間的協(xié)作結(jié)合和協(xié)同效應(yīng)基因組足跡模式和體外足跡模式的比較蛋白質(zhì)-DNA相互作用的相對親和力顯性失活突變體體外轉(zhuǎn)錄策略改變特異性實驗參考文獻9 內(nèi)源性控制區(qū)的體內(nèi)分析引言和概述實驗策略染色質(zhì)免疫沉淀DamIDDNase I和DMS基因組足跡專題9.1 連接介導(dǎo)PCR高錳酸鉀基因組足跡核小體存在和定位的Southern印跡分析專題9.2 通過MNase-Southern印跡分析進行核小體定位的低分辨率分析監(jiān)測核小體存在和定位的LM-PCR、PCR及ChIP策略用于分析核小體重塑的體內(nèi)方法的概述DNase I高敏感性監(jiān)測核小體重塑用于監(jiān)測核小體重塑的MNase方法限制性內(nèi)切核酸酶可及性分析專題9.3 限制性內(nèi)切核酸酶可及性-LM-PCR分析染色質(zhì)構(gòu)象捕獲DNA甲基化技術(shù)方案9.1 MNase-Southern印跡分析方案9.2 LM-PCR方法方案9.3 染色質(zhì)免疫沉淀參考文獻10 鑒定和表征轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的結(jié)構(gòu)域引言和概述實驗策略:定義結(jié)構(gòu)域功能結(jié)構(gòu)域的鑒定專題10.1 結(jié)構(gòu)域的計算分析基本突變原理專題10.2 表達系統(tǒng)專題10.3 標簽識別與檢測的通用方法序列特異性調(diào)控因子的結(jié)構(gòu)域分離序列特異性調(diào)控因子的DNA結(jié)合和激活/抑制結(jié)構(gòu)域?qū)ｎ}10.4 VP16激活結(jié)構(gòu)域:個案研究專題10.5 GAL4:個案研究專題10.6 KRAB抑制結(jié)構(gòu)域:個案研究細分DNA識別亞結(jié)構(gòu)域和寡聚化亞結(jié)構(gòu)域概念和策略: 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用共激活因子和共抑制因子的分離及克隆研究激活結(jié)構(gòu)域與共激活因子相互作用的方法通過親和層析研究激活/抑制結(jié)構(gòu)域與其靶標之間的相互作用改變特異性遺傳系統(tǒng)通用轉(zhuǎn)錄機器的結(jié)構(gòu)-功能分析共激活因子的分析技術(shù)方案10.1 PCR介導(dǎo)的定點突變參考文獻11 DNA的調(diào)控性轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合引言和概述實驗策略DNA-蛋白質(zhì)相互作用的一般理論和實例專題11.1 Kd情況的例子DNA-蛋白質(zhì)相互作用的分析及建模專題11.2 SAAB分析專題11.3 DNase I足跡和外切核酸酶足跡專題11.4 用于小溝相互作用的化學(xué)探針啟動子特異性多組分核蛋白復(fù)合物的分析技術(shù)方案11.1 DNase I足跡方案11.2 羥自由基足跡方案11.3 磷酸乙基化干擾分析方案11.4 甲基化干擾分析方案11.5 電泳遷移率變動分析方案11.6 32P末端標記DNA片段的準備參考文獻12 體外轉(zhuǎn)錄和起始前復(fù)合物組裝引言和概述實驗策略提取物的制備轉(zhuǎn)錄分析專題12.1 測定體外轉(zhuǎn)錄的方法分級分離的系統(tǒng)專題12.2 純化的轉(zhuǎn)錄因子基本起始前復(fù)合物的形成開放復(fù)合物的形成、起始和啟動子逃脫活化復(fù)合物在啟動子上的組裝技術(shù)核提取物制備:概述方案12.1 Dignam和Roeder核提取物方案12.2 使用HeLa細胞提取物和引物延伸的體外轉(zhuǎn)錄方案12.3 使用HeLa細胞核提取物的無G序列盒體外轉(zhuǎn)錄共激活因子的純化(方案12.4和方案12.5)方案12.4 表位標記TFIID的純化方案12.5 從表達FLAG標記調(diào)解因子亞基的HeLa細胞系中純化調(diào)解因子方案12.6 固定化模板分析方案12.7 Pol II開放復(fù)合物的高錳酸鉀探測方案12.8 DNA結(jié)合TFIID的鎂-瓊脂糖EMSA參考文獻13 體外研究染色質(zhì)動力學(xué):染色質(zhì)組裝、重塑和轉(zhuǎn)錄引言和概述實驗策略用于組裝染色質(zhì)的策略專題13.1 DNA模板和重建方法對陣列內(nèi)核小體定位的影響組蛋白來源染色質(zhì)重建的生化表征專題13.2 核小體陣列的MNase分析專題13.3 核小體陣列的EcoRI酶切分析體外測驗組蛋白修飾作用策略染色質(zhì)重塑/修飾酶的分析以染色質(zhì)模板進行體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)方案13.1 雞紅細胞組蛋白八聚體制備方案13.2 核小體的鹽梯度透析重建方案13.3 利用重組的果蠅ACF和NAP1重建核小體陣列參考文獻附錄:注意事項索引

章節(jié)摘錄

　　通過分析用特定報告質(zhì)粒得到的數(shù)個獨立克隆，可以獲得所得到的活性范圍和平均活性的相關(guān)知識。當嘗試比較控制區(qū)在不同細胞系中的活性，或嘗試比較野生型控制區(qū)和突變型控制區(qū)時，這一信息非常有價值。克隆與克隆之間的變異性使這些對比難以進行，但是，如果知道了變異性的程度就能很有幫助。如果目的是監(jiān)測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞中特定控制區(qū)的誘導(dǎo)活性，那么分離和分析單個細胞克隆就同樣重要，這是因為整合位點會影響誘導(dǎo)的程度?！　》治黾毎寺?。盡管對幾個不同克隆的分析是有價值的，但是在多數(shù)情況下，沒有必要嚴格地確定每個假定克隆都確實是克隆的。如果96孔板上的一小部分孔中含有抗藥性群落，那么每個群落就可能是克隆的。對于某些實驗，明確地確定每個群落都是克隆的（通過極限稀釋對細胞進一步亞克隆，以及通過Southern印跡分析確定整合位點）可能很重要。然而，因為幾個細胞克隆將會被比較，并且預(yù)計由于整合位點的差異有相當大的變化，因此某些樣品的寡克隆一般不會產(chǎn)生大的影響。拷貝數(shù)的嚴格確定（通過定量的Southern印跡或?qū)崟rPCR）也可能沒有必要，除非需要精確確定以單個克隆觀察到的變化中有多少變化歸因于拷貝數(shù)的變化，而又有多少變化歸因于整合位點的變化。在某些情況下，該信息是有用的，如確定一個控制元件是否符合LCR的定義。然而，對于大多數(shù)基因調(diào)控研究來說，該信息價值有限?！　》治黾毎?。分離幾個單個克隆的替代方法是比較幾個獨立的細胞池，這一策略的潛在優(yōu)勢是由整合位點和拷貝數(shù)的差異造成的各池中的變異可被平均，從而減小池間的差異；其缺點是如果一個或少數(shù)克隆表現(xiàn)出由報告基因或抗藥性基因的整合位點或表達水平造成的生長優(yōu)勢，池中每個克隆的相對豐度會隨時間劇烈變化。其實，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞的細胞池可以非常迅速地成為寡克隆或單克隆。因此，不能假定對細胞池的分析可以產(chǎn)生對許多克隆系進行單獨分析時獲得的平均結(jié)果。而且，在某一時刻以細胞池獲得的結(jié)果可能不同于將細胞傳代數(shù)周后獲得的結(jié)果，這是因為細胞的選擇性過度生長十分常見。因此，需要注意的是，相對于當分離了單個克隆時檢驗的數(shù)目，細胞池的使用不能減少以每個報告質(zhì)粒所需檢驗的樣品數(shù)目。雖然細胞池的使用理論上可產(chǎn)生來自大量單個克隆的平均報告基因信號，但是一個或少數(shù)幾個克隆選擇性過度生長的可能性使得對幾個細胞池進行檢驗成為必要。對照及結(jié)果的解釋　　穩(wěn)定轉(zhuǎn)染分析中，需要用對照確證啟動子受到正確調(diào)控。如果啟動子預(yù)期是細胞類型特異性的，那么用不同細胞系進行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染實驗就可以確定這一點。正如瞬時轉(zhuǎn)染實驗，用病毒啟動子／增強子驅(qū)動的報告基因進行平行實驗，將有利于對從不同細胞系獲得的結(jié)果進行歸一化處理。　　……

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