分子診斷學實驗指導

內(nèi)容概要

本教材共四篇24個實驗。第一篇基本實驗操作，介紹分子診斷學實驗室的常規(guī)儀器設(shè)備、安全注意事項及基本實驗操作技術(shù)；第二篇基礎(chǔ)訓練型實驗，介紹分子診斷學基本實驗技術(shù)，包括核酸的提取及鑒定、PCR技術(shù)、分子雜交技術(shù)、DNA測序技術(shù)。第三篇綜合提高型實驗及第四篇研究應用型實驗，著重對綜合性、設(shè)計性、應用性實驗以及適用于臨床或有臨床應用前景的分子診斷實驗進行了介紹。尤其介紹了最新的分子診斷臨床項目，如EGFR基因突變的檢測、PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析、BCR/ABL融合基因的檢測和定量PCR的質(zhì)量控制中檢測靈敏度、準確度、特異度判斷等。每個檢查項目讓學生掌握技術(shù)原理、實驗方法和標準操作規(guī)程，在此基礎(chǔ)上，結(jié)合分子診斷臨床應用的特點，讓學生了解臨床常用分子診斷檢測項目的臨床意義以及分子診斷室質(zhì)量控制方法。
《分子診斷學實驗指導》可供高等院校醫(yī)學檢驗專業(yè)、衛(wèi)生檢驗專業(yè)學生實驗使用，也可供從事臨床檢驗工作和醫(yī)學研究的技術(shù)人員參考使用，并可用作臨床醫(yī)學、醫(yī)學影像學、麻醉學、法醫(yī)學、預防醫(yī)學以及藥學專業(yè)實驗教學的參考用書。

作者簡介

黃韻祝、張吉才、黃山、楊紅英

書籍目錄

第一篇 基本實驗操作實驗一 分子診斷學實驗室的常規(guī)儀器設(shè)備及有關(guān)操作實驗二 分子診斷學實驗基本操作技術(shù)及安全注意事項第二篇 基礎(chǔ)訓練型實驗實驗三 基因組DNA的分離實驗四 質(zhì)粒DNA的提取與鑒定實驗五 真核細胞RNA的制備實驗六 核酸濃度及純度鑒定實驗七 質(zhì)粒DNA的限制性核酸內(nèi)切酶酶切分析實驗八 聚合酶鏈反應實驗九 人β-肌動蛋白mRNA反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測實驗十 探針的制備實驗十一 熒光原位雜交實驗十二 Western印跡分析法實驗十三 DNA測序技術(shù)第三篇 綜合提高型實驗實驗十四 ApoE基因多態(tài)性的檢測實驗十五 多重Gap-PCR進行α-地中海貧血基因診斷實驗十六 反向點雜交法進行β-地中海貧血基因診斷實驗十七 熒光定量PCR技術(shù)檢測乙型肝炎病毒(HBV)核酸實驗十八 熒光定量PCR技術(shù)檢測HCV RNA實驗十九 PCR-SSCP檢測p53基因的突變實驗二十 BCR/ABL融合基因核酸的定量檢測實驗二十一 EGFR基因突變的檢測第四篇 研究應用型實驗實驗二十二 熒光定量PCR擴增檢測儀的維護和光路校準實驗二十三 PCR檢驗室內(nèi)質(zhì)控圖的建立和應用實驗二十四 熒光定量乙型肝炎病毒PCR試劑盒性能評價附錄參考文獻彩圖

章節(jié)摘錄

第一篇  基本實驗操作實驗 一  分子診斷學實驗室的常規(guī)儀器設(shè)備及有關(guān)操作 【實驗目的】 掌握分子診斷學實驗室常規(guī)儀器設(shè)備的功能和使用方法。 【實驗器材】 溫度控制系統(tǒng)、水凈化裝置、滅菌設(shè)備、計量設(shè)備、離心設(shè)備、電泳裝置、超凈工作臺、PCR 儀等。 【實驗內(nèi)容】 （一） 溫度控制系統(tǒng) 1.冰箱 根據(jù)藥品、試劑及多種生物制劑保存的需要，必須具備不同控溫級別的冰箱，最常使用的有4℃ 、- 20℃ 和- 80℃ 冰箱。 4℃ 冰箱適用于儲存某些溶液、試劑、藥品等。 - 20℃ 冰箱適用于某些試劑、藥品、酶、血清、配好的抗生素和DNA 、蛋白質(zhì)樣品等的保存。 - 80℃ 冰箱適用于某些長期低溫保存的樣品、純化的樣品、特殊的低溫處理消化液等的保存。 0～10℃ 的冷柜適用于低溫條件下的電泳、層析、透析等實驗。 2.液氮罐 某些實驗材料，如細胞株、菌株、組織標本以及純化的樣品等要求速凍或長期低溫保存，應放置在更低溫度的環(huán)境中，液氮罐就是這樣的冷凍保存裝置，它可達- 196℃ 的低溫。液氮罐為雙層結(jié)構(gòu)，中間為真空層，在罐內(nèi)盛放液氮。其規(guī)格有多種，如10L 、15L 、30L 、35L 、50L 等，可根據(jù)需要選用。初次啟用液氮罐時，應緩慢加入液氮，使容器內(nèi)部溫度均勻下降，液氮溫度低，切勿濺到皮膚上，以防凍傷。凍存細胞時，應逐步降溫，不能直接將待凍存的細胞放入液氮罐，而應先經(jīng)- 20℃ 過夜，再經(jīng)- 70℃ 過夜后轉(zhuǎn)入液氮罐保存。 3.培養(yǎng)箱 37℃ 恒溫箱主要用于細菌的固體培養(yǎng)和細胞培養(yǎng)；CO2 培養(yǎng)箱適用于培養(yǎng)各種細胞；利用37℃ 恒溫空氣搖床可以進行液體細菌的培養(yǎng)。 4.水浴箱 水浴箱有不同類型，可根據(jù)需要選用。25～100℃ 水浴搖床可用于分子雜交、各種生物化學酶反應等實驗的保溫；25～100℃ 水浴箱用于常規(guī)實驗；循環(huán)式或恒溫水浴箱是可以制冷也可以加熱的水浴箱，主要用于DNA 探針缺口標記、酶反應試驗、電泳冷卻循環(huán)用水等。 5.烤箱 烤箱主要用于烘干實驗器皿，有些需要溫度高些，有些需要溫度低些，如涉及RNA實驗的用具，就需要在250℃ 烤箱中進行烘干，而有些塑料用具只能在42～45℃ 的烤箱中進行烘干。 （二） 水凈化裝置 隨著分子診斷學的飛速發(fā)展，許多實驗對水的純度要求很高。 1.蒸餾水器 它的工作原理是利用液體遇熱氣化遇冷液化的原理制備蒸餾水。單蒸水常難以滿足實驗要求。雙蒸水、三蒸水可用于試劑配制，許多實驗要求采用去離子水。 多次蒸餾水可除去水中揮發(fā)性雜質(zhì)，不能完全除去水中溶解的氣體雜質(zhì)。 2.離子交換器 用離子交換法制備的水稱去離子水。離子交換器去離子效果好，但不能除去水中的非離子型雜質(zhì)，其中常含有微量的有機物（樹脂等）。 3.超純水 用蒸餾水、離子交換水、反滲透純水作為供水，磁鐵耦合齒輪泵作用使水循環(huán)制備而得。用于PCR 、氨基酸分析、DNA 測序、酶反應、組織和細胞培養(yǎng)等。 （三） 滅菌設(shè)備 細菌和細胞培養(yǎng)及核酸等有關(guān)的實驗，所用的試劑、器皿及其他實驗用具，應嚴格滅菌，有的實驗還要求沒有核酸酶的污染，故應將實驗器械、試劑等進行高壓滅菌。對于經(jīng)過導入DNA 重組分子的菌株，操作后必須進行嚴格的高壓滅菌處理。常用的滅菌器械有：蒸汽高壓鍋、干烤箱、過（超）濾器、紫外燈、酒精燈等。此外，消毒劑浸泡也是常用的滅菌方法。 （四） 計量設(shè)備 1.液體體積度量系統(tǒng) 除各種量筒、移液管、容量瓶等液體容器外，各種型號的微量加樣器是分子診斷學實驗中經(jīng)常使用的液體量取器具。 2.稱量設(shè)備 最常用的稱量工具是各種不同感量的天平和電子天平等，它們適用于各種緩沖液的配制和標準物質(zhì)的稱量。大于或等于0.1g 的物質(zhì)常用雙托盤天平稱量，而0.1g 以下物質(zhì)應使用電子天平稱量。 3.pH 測量系統(tǒng) pH 計：是測定溶液中H + 濃度的儀器，主要通過一對電極，在不同的pH 溶液中產(chǎn)生不同的電動勢用pH 表示出來。 pH 試紙：只適用于培養(yǎng)液、緩沖液或其他試劑溶液的pH 的粗略估計。而大部分試劑的配制要求嚴格的pH ，需精確度高（小數(shù)點后兩位）的pH 計。 4.分光光度計 分光光度計是利用物質(zhì)在可見光和紫外線區(qū)域中的吸收光譜來鑒定該物質(zhì)的性質(zhì)及其含量的一種儀器。它是由光源、單色器、吸收池、接收器、測量儀表或顯示屏幕所組成。吸光度值是許多溶液中溶質(zhì)定量的方便指標之一，通過所產(chǎn)生的單色光測定某一溶液對該單色光的吸收值，利用它可進行核酸溶液定量和純度的初步判斷。主要有可見分光光度計、紫外/可見分光光度計等。 （五） 離心設(shè)備 在分子診斷學實驗過程中，離心技術(shù)是最常用的技術(shù)之一。主要利用離心機轉(zhuǎn)頭轉(zhuǎn)動時產(chǎn)生的強大離心力場對物質(zhì)進行沉淀、分離、純化、濃縮等處理。離心機按其轉(zhuǎn)速分為低速（普通）離心機、高速離心機和超速離心機三種類型。通過這些離心機的使用，可以完成分子診斷學研究中分離、提純、鑒定、生物大分子分析等重要的研究工作。 1.普通離心機 普通離心機最大轉(zhuǎn)速為6000r/min ，最大離心力為6000g 。 （1） 醫(yī)用或臺式離心機：是離心機中最簡單且廉價的，最常用于壓緊或收集小量快速沉降的物質(zhì)，如紅細胞、粗大的沉淀物、酵母菌和細菌等。 （2） 低速冷凍離心機：主要用于細胞、細胞核、細胞膜、細菌的沉淀和收集等。 2.高速離心機 高速離心機最大轉(zhuǎn)速為25 000r/min ，最大離心力為89 000 g 。多用于制備、收集微生物、細胞碎片、細胞、大的細胞器、硫酸銨沉淀物以及免疫沉淀物等。 臺式高速冷凍離心機（3K15） 由德國SIGMA 公司生產(chǎn)，最大離心力可達23031g ，最大容量可達4×200ml ，用于混合樣品中目標組分的分離與鑒定。其操作程序如下： （1） 開蓋并安裝轉(zhuǎn)子。 （2） 打開電源，設(shè)置轉(zhuǎn)子、轉(zhuǎn)速、時間、溫度等參數(shù)。 1） 按“Deckel Lid Couvercle”鍵開倉門，把所需的轉(zhuǎn)子放入倉內(nèi)，卡入螺釘，用扳擰緊，加轉(zhuǎn)子蓋。 2） 按轉(zhuǎn)速面板中功能選擇鍵，選到“Rotor”后再按“Edit”鍵，此時轉(zhuǎn)速面板顯示窗中數(shù)字閃動，通過“ ↑ ”或“ ↓ ”鍵將顯示窗中的數(shù)字設(shè)為與轉(zhuǎn)子編號一致，按“ Enter” 鍵確定。 3） 按轉(zhuǎn)速面板中功能選擇鍵，選到“Drehzahl Speed Vitesse”后再按“Edit”鍵，此時轉(zhuǎn)速面板顯示窗中數(shù)字閃動，通過“ ↑ ” 、“ ↓ ” 、“ ← ”或“ → ”鍵設(shè)置所需轉(zhuǎn)速（不同的轉(zhuǎn)子有不同的最高轉(zhuǎn)速，請注意設(shè)置） ，按“Enter”鍵確定。 4） 按溫度和時間面板中功能選擇鍵，選到“Zeit Time Minuterie”后再按“Edit”鍵，此時溫度和時間面板顯示窗中數(shù)字閃動，通過“ ↑ ” 、“ ↓ ” 、“ ← ”或“ → ”鍵設(shè)置所需時間，按“Enter”鍵確定。 5） 按溫度和時間面板中功能選擇鍵，選到“ Temperatur”后再按“Edit”鍵，此時溫度和時間面板顯示窗中數(shù)字閃動，通過“ ↑ ” 、“ ↓ ” 、“ ← ”或“ → ”鍵設(shè)置所需溫度，按“Enter”鍵確定。 6） 轉(zhuǎn)速、時間、溫度等參數(shù)都設(shè)置好后關(guān)倉門，預冷離心機到所需溫度。 7） 程序面板“Programm”中的程序已經(jīng)設(shè)置好，不需要進行設(shè)置，請不要隨便更改。 （3） 嚴格平衡離心樣品管，開倉放樣品管，擰緊轉(zhuǎn)子蓋，關(guān)倉門，按“ Start”鍵開機工作。如果平衡警告燈“ Unwucht Imbalance Balourd”亮起，提示離心樣品管沒有達到平衡，必須重新配平。按“Deckel Lid Couvercle”鍵開倉門取出離心樣品管重新配平，配平后重新開始離心。 （4） 離心結(jié)束，按“Deckel Lid Couvercle”鍵開倉門取出離心樣品管，關(guān)電源擦拭離心機內(nèi)倉和轉(zhuǎn)子。將離心機倉門打開，不要扣上，讓離心機內(nèi)倉的冷凝水蒸發(fā)干，以免發(fā)生離心機運轉(zhuǎn)時電源短路燒壞機心。 （5） 使用注意事項 1） 嚴格平衡樣品。 2） 每次使用離心機前，都要將離心機內(nèi)倉里的水擦干，避免水下漏發(fā)生電源短路燒壞機心。 3） 必須預冷離心機到所需的溫度，才能開始運行儀器。 4） 每次離心時必須把轉(zhuǎn)子蓋旋緊蓋好。離心過程中如果發(fā)生異常響聲，按“Stop”鍵停止，報告實驗室老師。 5） 離心結(jié)束，關(guān)閉電源，打開倉門，擦拭離心機內(nèi)倉和轉(zhuǎn)子。 6） 嚴禁樣品灑落弄臟離心機內(nèi)倉，以免儀器發(fā)生意外事故。 3.超速離心機最大轉(zhuǎn)速90 000r/min ，最大離心力694 000 g 。 （六） 電泳裝置 電泳技術(shù)是檢測、鑒定各種生物大分子的純度、含量及描述它們的特征，甚至還是分離、純化、回收和濃縮樣品的工具之一。電泳裝置由電泳儀和電泳槽兩部分組成。 1.電泳儀 它是作為電泳時的外加電源設(shè)備，將220V 交流電整流后通過穩(wěn)壓器，它既能輸出穩(wěn)定的電流，又能輸出穩(wěn)定的電壓，起到在被分離樣品兩端加外接電場的作用。 常壓電泳儀：一般為輸出0～500V 和0～150mA 的電源裝置。 中壓電泳儀：一般為輸出400～1000V 的電源裝置。 高壓電泳儀：一般為輸出1000V 以上的電源裝置。 2.電泳槽裝置 （1） 水平式電泳槽：可用于乙酸纖維薄膜電泳、瓊脂糖凝膠電泳等。瓊脂糖水平電泳是分離、鑒定和純化DNA 片段的標準方法。采用低濃度的熒光嵌入染料溴化乙錠進行染色，可以確定DNA 在凝膠中的位置，用瓊脂糖凝膠電泳可以分離200bp～50kb的DNA 。 （2） 垂直式電泳槽：分為垂直平板電泳槽和圓柱形電泳槽裝置。垂直平板電泳槽也是分離、鑒定、純化DNA 片段的標準方法。一般用聚丙烯酰胺凝膠作為分離載體，其分辨率較瓊脂糖凝膠電泳高，相差僅1 bp 的DNA 都可分開。它的加樣量大，從聚丙烯酰胺凝膠中回收的DNA 樣品純度很高。常用的聚丙烯酰胺凝膠有兩種：一種是用于分離、純化雙鏈DNA 片段的非變性聚丙烯酰胺凝膠；另一種是用于分離、純化單鏈DNA 片段的變性聚丙烯酰胺凝膠。變性聚丙烯酰胺凝膠需加入尿素或甲醛等變性劑，主要用于放射性DNA 探針的分離、S1 核酸酶消化產(chǎn)物的分析及DNA 的測序。 （七） 超凈工作臺 超凈工作臺是細胞培養(yǎng)及無菌實驗操作工作中最重要的設(shè)備之一，在分子診斷學實驗室中細菌增殖、質(zhì)粒的純化等都需要在超凈工作臺中進行。工作原理即內(nèi)設(shè)鼓風機驅(qū)動空氣通過高效的過濾裝置而得到凈化，凈化后的空氣通過工作臺面形成無菌環(huán)境。根據(jù)濾器中濾墊的微孔徑和密度的不同，除濾過細菌等微生物外，對病毒的通過也有一定的阻擋作用。 超凈工作臺根據(jù)凈化氣流的流動方式分為側(cè)流式、直流式、外流式等幾種類型。 （八） PCR 儀 PCR 儀也稱DNA 熱循環(huán)儀、基因擴增儀。它使一對寡核苷酸引物結(jié)合到正、負DNA 鏈上的靶序列兩側(cè)，從而酶促合成拷貝數(shù)為百萬倍的靶序列DNA 片段，它的每一循環(huán)包括在三種不同溫度進行DNA 變性、引物復性、DNA 聚合酶催化的延伸反應三個過程。 Eppendorf PCR 5331 儀操作規(guī)程： （1） 打開儀器后面電源開關(guān)。 （2） 進入主菜單后進行程序編寫。 （3） 選擇“FILES”后按“ENTER”鍵進行程序編輯。 （4） 選擇“EDIT” ，按“ENTER”鍵，進行所使用程序的編寫。 （5） 程序編寫完后，選擇“ EXIT” ，按“ ENTER” 鍵，這時屏幕出現(xiàn)是否保存，選擇YES ，就可以保存程序，設(shè)定好的程序名可任選，按“ OPTION”鍵進行程序的命名。如果不需要保存，則按“OPTION”鍵，選擇“ NO” ，則程序沒有被保存。 （6） 在進行程序編寫時，如果默認的程序不夠時，可以按“INSERTION”鍵進行程序的增加，如果默認的程序多時，選擇“DELETION”刪除。 （7） 程序編寫完后，回到主菜單選擇“START” ，按“ENTER”鍵，則進行程序的運行。 （8） 在程序進行運行的過程中，可以查看程序運行完畢的時間。選擇“ OPTION”鍵就可以查看。 （9） 如果“PCR”儀器內(nèi)所能容納的程序滿后，可以將一部分不用的程序刪除。則可選擇“FILES” ，進入“ LOAD” ，選擇需要刪除的程序名，然后選擇DELETION 鍵刪除不需要的程序。 （10） 如需要在原來編號的程序上修改運行程序，則選擇“FILES” ，進入“ LOAD” ，進行程序的修改，修改完畢后也需要保存。 （11） 當程序運行完畢時，選擇“STOP” ，按“ENTER”鍵確認，回到主菜單，即可關(guān)閉電源，取出樣品。 （九） 紫外分析儀及凝膠成像分析系統(tǒng) 本系統(tǒng)用于對電泳后含溴化乙錠（EB）的核酸樣品進行觀察及結(jié)果記錄。電泳后的DNA 肉眼是觀察不到的，它必須與溴化乙錠（EB）結(jié)合，在紫外燈的照射下產(chǎn)生熒光來進行觀察。一般采用由紫外燈發(fā)射的300～360nm 波長的紫外線，用于核酸分析的紫外分析儀常采用254nm 、300nm 、365nm 等幾個波長，在此波長范圍內(nèi)，DNA 與EB 結(jié)合物對紫外光吸收較強，從而誘導產(chǎn)生590nm 波長的橙紅色熒光。產(chǎn)生熒光的強度及樣本帶的大小與DNA 量相關(guān)，其遷移率與DNA 分子的大小相關(guān)，也可根據(jù)樣本帶的形狀判斷其純度。 近年來許多廠家都推出了先進的凝膠成像系統(tǒng)，由于它具有強大的圖像采集、軟件分析能力，可以對DNA 、RNA 、蛋白質(zhì)電泳凝膠以及各類雜交，放射自顯影結(jié)果進行拍攝、處理、分析和保存。由于可以在計算機上進行分析處理，其應用越來越廣泛。 （十） 其他設(shè)備 1.微波爐 微波爐用于一些溶液的快速加熱與定溫加熱，如對配制的電泳瓊脂糖凝膠液進行熔化。 2.真空加熱干燥箱 廣泛應用于核酸在硝酸纖維素膜和尼龍膜上的固定，用于Southern 、Northern 等雜交實驗。 3.電泳凝膠干燥器 這是將電泳后的凝膠進行脫水干燥的儀器，一般可將凝膠干燥到一張玻璃紙上，干燥后的凝膠易于保存。 4.印跡系統(tǒng)、DNA 合成/測序儀這些都是對核酸進行深入研究的必備儀器?！舅伎碱}】 （1） 分子診斷學實驗室的常規(guī)儀器設(shè)備有哪幾大類？ 簡要說明。（2） 蒸餾水與去離子水的區(qū)別？ PCR 技術(shù)需要哪種純度的水？（方  文）

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