天然產物活性成分分離

內容概要

　　本書將編入天然活性成份分離的最新技術，如超臨界流體提取、微波提取、高效逆流層析、高效液相色譜-核磁-質聯用分析、凝膠層析等。扼要介紹復雜天然化學成份結構的波譜解析方法，結構修飾與前藥制備方法。在各論中作者除介紹自己的經驗外，還編寫了我國市場常見天然藥物、甜味劑、色素、殺蟲劑如：紫杉醇、青蒿素、喜樹堿、甜菊苷、除蟲菊脂等的最新分離方法，并附有各種層析顯色試劑，緩沖流制備方法及性能表等作為附錄便于查閱。
　　本書可作為天然產物化學，有機化學，藥物化學，植物化學，分析化學等領域教學、科研工作者及中西藥制藥公司與農業(yè)和食品工業(yè)有關人員的參考書和案頭常用的工具書。

作者簡介

徐任生，理學博士，教授。1931年生，江蘇金壇人。畢業(yè)于前蘇聯大學及其研究生院。先后在中國科學院上海藥物研究所、美國中藥科學研究中心(Pharmagenseis)從事天然產物化學與中藥現代化研究。主編《天然產物化學》、《黃酮體化合物鑒定手冊》等六部專著，發(fā)表學術論文180佘篇。曾獲國家自然科學二等獎，中國科學院自然科學三等獎等。為國產藥地高新、西地蘭、10-羥基喜樹堿及雷公藤內酯醇的研究與開發(fā)做出了重要貢獻。曾兼任ILIPAC藥物化學組和LJNESCO東南亞天然產物化學組中國代表，國家自然科學基金委員會有機化學組評審員，上海藥學會副理事長及上海醫(yī)科大學兼職教授等職?，F為中國科學院上海藥物研究所、IOCD(國際化學發(fā)展組織)和《中國天然產物》編委會的學術顧問，Phytochemical Analysis、Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences和《天然產物研究與發(fā)展》等雜志編委。

書籍目錄

主編的話
第一篇　分離方法與技術
　第1章　中草藥有效成分的提取與分離
　第2章　結晶與純度鑒別
　第3章　超臨界流體萃取技術的應用
　第4章　微波輔助萃取技術的應用
　第5章　大孔吸附樹脂的應用
　第6章　高效液相色譜及其聯用技術
　第7章　高效快速中壓制備色譜
　第8章　逆流色譜
　第9章　凝膠色譜
　第10章　優(yōu)化傳統(tǒng)提取與分離技術
　第11章　天然產物的結構鑒定
　第12章　結構修飾與前藥制備
　第13章　天然產物的生物活性篩選
第二篇　各論
　第14章　生物堿
　第15章　黃酮類化合物
　第16章　酚類和木脂體類化合物
　第17章　香豆素
　第18章　蒽醌和花青素
　第19章　萜類化合物
　第20章　皂苷
　第21章　強心苷
　第22章　核苷
　第23章　多糖及寡糖
　第24章　肽、蛋白質與酶
　第25章　海洋天然產物
　第26章　其他生物活性成分
附錄
主題詞索引
動、植物名稱索引(拉丁文)　

章節(jié)摘錄

第1章中草藥有效成分的提取與分離 1。1概述 隨著生活水平的不斷提高，人們更關注自身的健康，對安全、高效治療藥物的需求更加迫切。研究新藥需要對大量化合物進行活性篩選，發(fā)現新藥先導化合物。天然產物是新藥先導化合物的重要來源之一。據統(tǒng)計，在1981～2002年全世界新發(fā)現的877個小分子藥物中，61%源于天然產物或其結構類似物［1］。地球上預計存在的50萬種開花植物中只有半數有文字記載，人們只對其中10%的植物進行過化學研究，而且很多研究工作還很粗淺。中草藥是中華醫(yī)學寶庫中的瑰寶，是中華民族幾千年與疾病作斗爭的經驗總結。從《神農本草經》記載的365味藥發(fā)展到明末李時珍《本草綱目》收錄的1892味藥，人們對中藥的認識不斷深入。1994年出版的《中國中藥資源志要》收載了全國藥用植物、動物、礦物等中藥資源及部分從國外引種栽培或飼養(yǎng)的藥用資源共計12694種，其中藥用植物分布于383科2313屬共11020種（含種下等級1208個）［2］。中草藥有效成分是中草藥發(fā)揮功效的物質基礎。藥用植物中有效成分的含量與植物的生長區(qū)域、植物的采集季節(jié)、植物的部位、加工儲存條件以及氣候與生態(tài)的變化有關。除有效成分外，藥用植物中還可能存在一些與其具有協(xié)同、拮抗作用的成分以及有毒副作用的化學物質。研究確定中草藥的有效成分是建立質控方法，保證及提高中草藥及中成藥質量的前提，也是發(fā)現新藥先導化合物的有效途徑。中草藥一般具有多種臨床用途，因此我們在尋找它的有效成分時首先應該確定尋找目標，分別尋找其中有某種療效的有效成分，然后通過提取、分離純化和相應的體外、動物體內模型篩選以及臨床驗證，這樣多次反復實踐才能達到目的。例如目前臨床上作五加皮使用的藥材主要有兩類：一類是五加科植物細柱五加AcanthopanaxgracilistylusW。W。Smith的干燥根皮，《中華人民共和國藥典》（簡稱《中國藥典》）規(guī)定其正名為五加皮，別名南五加皮；另一類為蘿科植物杠柳PeriplocasepiumBge。的干燥根皮，《中國藥典》規(guī)定其正名為香加皮，別名北五加皮。舊本草中五加皮沒有南、北之分，統(tǒng)稱為五加皮。香加皮具有風濕，壯筋骨的作用，其中含有強心苷類成分，如果過量飲用以香加皮泡制的藥酒會導致中毒。近期研究還發(fā)現香加皮含有的一些孕甾烷糖苷在多種自身免疫性疾病動物模型上顯示良好治療效果［3～6］。 天然產物的分離純化與結構鑒定曾是十分耗時的工作。隨著色譜和波譜技術的進步，許多純化工作可以通過自動化儀器來實現，大部分結構解析工作也可在較短時間內完成。人們逐漸把目光轉向生物活性跟蹤分離。研究發(fā)現新活性天然產物需加強化學與生物活性測試等方面的協(xié)作。對篩選發(fā)現的活性提取部位進行跟蹤分離可減少工作的盲目性，且不容易漏掉可能存在的微量生物活性成分。鑒于中草藥臨床用途的多樣性及中草藥成分可能具有的多靶點作用，選擇相關及適當廣泛的篩選模型進行測試會促進發(fā)現新的有效成分。 1。2文獻檢索與預試驗 天然產物源于動物、植物、微生物和礦物，中草藥主要以植物類為主。本章主要介紹植物化學成分的提取和分離方法。植物的化學成分很復雜，普遍含有蛋白質、糖類、淀粉、纖維素、樹脂、葉綠素及無機鹽等。此外，植物還可能分別含有生物堿、萜類、甾體、類黃酮、苯丙素、糖苷、有機酸、氨基酸等小分子次生代謝產物。 盡管植物中的化學成分通常比較復雜，但同科、同屬植物資源所含的化學成分 具有結構相似性。因此，在著手研究一種中草藥的有效成分時，首先應通過文獻檢索，了解同科屬植物中含有哪些類型的化學成分、這些化學成分及其類似物已報道具有哪些生物活性，從而將粗提物或部位在相關篩選模型上進行測試，對有活性的粗提物或部位進行生物活性導向的跟蹤分離，這樣有利于更有效地發(fā)現生物活性成分。SciFinder、Reaxys和CombinedChemicalDictionary（CCD）等數據庫使檢索同科、同屬植物化學成分及生物活性變得十分方便。 在信息檢索的基礎上，可對植物粗提取物進行薄層色譜（TLC）分析，采用不同極性的展開劑可幫助初步了解粗提物中主要小分子化合物的數目、各化合物之間的大致含量比例，是否含有高極性糖苷類化合物等信息。對展開后的薄層板用各種定性試劑顯色，可進一步判斷所含化合物的結構類型，如用碘化鉍鉀（Dragendorff）試劑檢測是否含有生物堿類化合物、用三氯化鐵試劑檢測是否含有酚類化合物等。定性試劑顯色也會有例外情況發(fā)生，影響到預試驗的結果。如碘化鉍鉀試劑對香豆素和萜類內酯也發(fā)生顯色反應，而咖啡因雖是生物堿，但對碘化鉍鉀試劑卻呈陰性反應。粗提物中如含有Vc等還原性物質，也會將三氯化鐵試劑中的三價鐵離子還原成亞鐵離子，產生顏色反應。由于植物所含成分復雜且可能產生相互干擾，其中的低含量化學成分通常也難以用定性試劑檢測發(fā)現。 隨著各種液質聯用（LC-MS）分析儀器的普及，對植物粗提物或分離得到的部位進行LC-MS/LC-UV分析，并結合文獻檢索得到的同科、同屬植物已知天然產物的相對分子質量和具有共軛基團化合物的紫外光譜特征，可以對粗提物或部位中的化學成分有更清晰的認識，了解哪些為未報道過的化合物。對分離得到的純化合物，若相對分子質量與數據庫中收集的同科、同屬植物中某一化合物的相對分子質量相同，選用與其相同的溶劑測定核磁共振氫譜（對氫譜信號復雜的化合物，如皂苷等，可進一步測定核磁共振碳譜），通過與文獻報道數據的比較，可快速鑒定多數已知結構化合物。掌握各種數據庫的檢索功能對提高工作效率十分重要。 1。3天然產物的提取 在提取天然產物前通常需對所提取的天然材料進行粉碎。粉碎程度不僅影響到提取效率，而且關系到有效成分的提出。如采用超微粉碎設備對靈芝孢子粉進行破壁，才可將其中的活性成分有效溶出；采用粉碎機械進行藥材粉碎時，由于高速撞擊摩擦會導致藥材溫度升高，可能破壞藥材中熱不穩(wěn)定化合物；先用液氮或冰箱放置對藥材降溫再進行粉碎有助于避免熱不穩(wěn)定化合物的化學結構變化。 選擇適當的提取方法不僅可以保證所需成分被提出，還可以盡量避免不需要成分的干擾，簡化后續(xù)的分離工作。有時只經過一步提取，即可獲得單體成分。以低極性溶劑提取可得到親脂性的組分，醇類溶劑則對極性與非極性物質都可溶出。若開始階段采用極性大的溶劑提取，接著用溶劑萃取方法可將提取物按極性大小分成不同的部位。 1。3。1傳統(tǒng)溶劑提取法 傳統(tǒng)溶劑提取法包括浸漬法、滲漉法、煎煮法、回流提取法及連續(xù)回流提取法等。 浸漬法提取天然產物，即將粉碎的天然原材料在容器內加溶劑浸泡，經過一段時間后倒出溶劑再加入新的溶劑浸泡，如此反復幾次至所需成分基本提取完全。 滲漉法是將粉碎的天然原材料置于一下面開口的容器內，不斷加入新溶劑，并通過控制下面出口大小連續(xù)收集浸提液（圖1。1）。由于原料不斷與新溶劑或含有低濃度提取物的溶劑接觸，始終保持一定的濃度差，滲漉法提取效果要比浸漬法好。根據需要可以采用單一溶劑進行滲漉，也可使用幾種溶劑依次進行滲漉。根據藥材體積的大小，可采用玻璃、陶瓷或不銹鋼等材料制成的不同大小的滲漉裝置進行提取。當用滲漉法提取植物花和葉等材料時，可在材料上部加一重物以減小體積。藥材的浸漬法和滲漉法一般提取溫度較低，提取物中所含雜質較少。采用滲漉法提取時，樣品不宜過細，以免溶劑流經原料層時速度太慢，影響傳質過程。 與上述兩種方法相比，煎煮法、回流提取法及連續(xù)回流提取法在較高溫度下對天然成分進行提取，提取效率更高，但雜質也相對較多。材料量少時以索氏（Soxhlet）提取器進行連續(xù)回流提取，具有操作簡單、節(jié)省溶劑的特點（圖1。2）。在不了解植物所含成分是否穩(wěn)定的情況下，一般應避免高溫提取，以防植物成分發(fā)生變化。 用溶劑提取天然材料時需考慮所用溶劑的沸點（沸點過高不易回收）、毒性及成本等因素。所用有機溶劑通常需呈惰性，即與所處理化合物不起化學反應。但惰性也不是絕對的，例如所用的甲醇、乙醇或正丁醇有時會與天然產物中的羧基形成相應的酯；用乙酸乙酯提取分離時，可能發(fā)生乙?；D移；使用丙酮時，可能會與天然產物中的二醇基團形成縮酮結構。充分考慮上述因素，有助于判斷所分得的化合物是否是真正的天然產物。在可用的提取溶劑中，水的成本最低，且非常安全。一些商品化的天然產物，如小檗堿、蕓香苷、甘草酸等在制備過程中采用水為提取溶劑。但用水提取，提取液中的雜質較多，如無機鹽、蛋白質、糖和淀粉等，給進一步分離帶來許多困難。乙醇是最常用的有機溶劑，具有低毒、價廉、沸點適中、便于回收利用等特點，且對植物細胞的穿透能力強，除了蛋白質、黏液質、果膠、淀粉和部分多糖等外，大多數有機化合物都能在乙醇中溶解。當植物中所含成分較為簡單或某一成分含量較高時，可根據其極性大小或溶解性能，選擇一種適當的溶劑把所需的成分提取出來，而雜質留在植物殘渣里。例如，細辛中含有一種中性物質細辛素，用石油醚回流，提取液濃縮即析出細辛素結晶，被石油醚一起提出的揮發(fā)油則留在母液中。又如，將橘絡粗粉置于索氏提取器中，用甲醇或乙醇回流提取，冷卻即析出橙皮苷結晶。 如果有效成分是酸性或堿性化合物，?？杉尤脒m當的酸或堿，再用有機溶劑提取。例如，生物堿在植物體中一般與酸結合成鹽存在，在生藥中加入適量的堿液，拌勻，使生物堿游離出來，再用有機溶劑提取。同樣，有機酸可加酸使其游離，然后用有機溶劑提取。反之，可以用酸性乙醇提取弱堿性生物堿。生物堿一般不溶于堿水，但有些酚性生物堿（如嗎啡）卻能溶于氫氧化鈉溶液中；有些生物堿的鹽不溶于水而溶于有機溶劑，不能用酸液提出。 為方便提取分離，有時要先對粉碎藥材進行一些預處理。如種子類藥材常含有大量油脂，可先采用石油醚脫脂或壓榨法除去油脂再用其他高極性溶劑提取。 1。3。2水蒸氣蒸餾法 此法適用于提取能隨水蒸氣蒸餾而不被破壞的植物成分。這些化合物與水不相混溶或僅微溶，且在約100℃時有一定的蒸氣壓。當水加熱沸騰時，能將該物質一并隨水蒸氣帶出。例如植物中的揮發(fā)油，某些小分子生物堿如麻黃堿、煙堿、檳榔堿等，以及某些小分子的酸性物質如丹皮酚等均可應用本法提取，對一些在水中溶解度較大的揮發(fā)性成分可用低沸點非極性溶劑如石油醚、乙醚抽提出來。如將徐長卿加水浸泡，然后水蒸氣蒸餾，蒸餾液用乙醚提取，醚提取液經濃縮即析出丹皮酚結晶。在對中藥香加皮的乙醇提取液進行減壓濃縮時，其中含有的4-甲氧基水楊醛會隨溶劑蒸發(fā)并冷凝于溶劑回收瓶中。在對一種新植物材料進行研究時，應注意避免具有該性質成分的損失。在提取天然材料時，也應注意使用回收溶劑可能引入的其他成分。 1。3。3超聲提取法 超聲波是在彈性介質中傳播的一種振動頻率高于聲波（20kHz）的機械波，能產生并傳遞強大的能量，給予媒質（如固體小顆?；驁F聚體）極大的加速度。當顆粒內部接受的能量足以克服結構的束縛能時，固體顆粒（或團聚體）被破碎（或解聚），從而促使細胞內有效成分的溶出。這種能量作用于液體，振動處于稀疏狀態(tài)時，液體會撕裂成很小的空穴，這些空穴一瞬間即閉合，閉合時產生高達幾十個大氣壓的瞬間壓力，即稱為空化現象。超聲提取技術的基本原理主要是利用超聲波的空化作用加速植物有效成分的浸出，另外超聲波的次級效應，如機械振動、乳化、擴散、擊碎、化學效應等也能加速欲提取成分的擴散釋放并充分與溶劑混合，利于提取。與常規(guī)提取法相比，超聲提取法具有提取時間短、產率高、無需加熱等優(yōu)點。郭等［9］用正交試驗對苦瓜黃酮的超聲提取工藝進行了優(yōu)化，并與傳統(tǒng)提取法進行了比較。選取了超聲波功率、提取時間、料液比為考察因素，每個因素設計了3個水平，由方差分析得出超聲波功率的改變對提取影響最大，其次是提取時間和料液比。綜合考慮各因素得出苦瓜黃酮超聲提取工藝條件為以90%的乙醇提取，超聲波功率為80W，提取20min，料液比為1∶30（g∶mL），與傳統(tǒng)提取方法對比，提取量為傳統(tǒng)方法的1。36倍，提取時間為傳統(tǒng)提取方法的1/9。國內目前已有廠家生產連續(xù)逆流超聲提取設備，可用于天然資源的大量提取。 此外，超臨界流體萃取、微波輔助萃取、空氣爆破等提取技術近年來在天然產物提取中也獲得日益廣泛的應用，縮短了提取時間、提高了提取效率。相關內容請參見本書第3章、第4章及其他相關資料。 1。4活性天然產物的分離 1。4。1經典方法 這里的經典分離方法是指從早期迄今一直被采用的方法，通常操作比較簡單，無需復雜、昂貴的儀器。 1。4。1。1液-液萃取法 天然產物的結構千差萬別，分子結構中極性基團的多少及取代位置決定了其在不同溶劑中的溶解性。極性化合物易溶于極性溶劑，非極性化合物易溶于非極性溶劑。對篩選發(fā)現的活性提取物，用溶劑分配法可快速將提取物按極性大小進行劃分，通過進一步活性測試可確定活性成分所在部位。結合使用各種去除葉綠素、鞣質、多糖的方法，可以減小后續(xù)分離的規(guī)模。該方法被廣泛用于從天然資源中尋找生物活性成分。 在提取分離皂苷類成分時，可先用工業(yè)酒精提取，對濃縮后的水液依次用低極性溶劑，如氯仿、乙酸乙酯從水中萃取出親脂性成分，然后通過正丁醇與水分配可使皂苷類成分富集于正丁醇部位，從而起到初步純化作用。在分離生物堿類成分時，在調節(jié)水相pH后，利用有機溶劑進行萃取，可使生物堿類成分得到富集，并可使強堿性生物堿與弱堿性生物堿得到初步分離。此外，在提取內酯類化合物時，可利用其不溶于水，但遇堿水解成為羧酸鹽而溶于水，加酸酸化后又回復原物而不溶于水的性質，從而與其他雜質分開。 在用同體積溶劑進行液-液萃取時，一般重復3～5次即可。可先進行小樣試驗，如容易產生乳化現象，大量萃取時不宜劇烈振搖。被萃取溶液濃度不宜過稀，以減少萃取溶劑用量。進行萃取時，如遇到兩相溶劑顏色都很深或顏色接近，可用燈光近距離照射，有助于分清界面。 1。4。1。2固相萃取法 固相萃取法（solidphaseextraction，SPE）是一種利用固相吸附劑純化樣品的方法。固相萃取可以達到去除雜質、脫鹽及濃縮被分析物的目的。固相萃取時可采用多種吸附劑，并可采用自動化儀器對大量樣品進行常規(guī)純化，已被廣泛用于樣品制備、分離及對分析樣品、活性測試樣品進行預處理。 固相萃取法可以采用下面兩種方式： （1）樣品中的干擾性雜質被吸附于萃取柱上，而所需的化合物被洗脫下來。

編輯推薦

《天然產物活性成分分離》：在我國，中草藥應用歷史悠久，植物資源豐富，是天然產物研究的核心內容之一。研究其有效成分，分析其活性，進行合成或結構修飾，可以創(chuàng)制新藥治愈令人類措手無策的疾??；也可以從中獲取天然殺蟲劑、甜味劑與色素等，滿足人們對于綠色食品的迫切需求。因此，天然產物活性成分的研究有廣闊的前景，是永遠研究不完的領域，并為國際同行所羨慕?！短烊划a物活性成分分離》一書的出版，將滿足廣大科研工作者的需要，對于推動天然產物的研究和發(fā)展將具有重要的作用?！短烊划a物活性成分分離》介紹了天然產物化學成分提取與分離的新技術和新方法，其中包括超臨界流體萃取、微波輔助萃取、高速逆流色譜、凝膠色譜、高效液相色譜與聯用技術、波譜解析化學結構、結構修飾與前藥制備、優(yōu)化傳統(tǒng)提取技術及生物活性篩選等。同時還介紹了有實際應用價值的各類常用天然活性成分的分離方法。許多內容是作者自己的實踐經驗總結。在附錄中收集了各種常用色譜顯色劑、緩沖溶液配制方法、大孔樹脂性能表及超濾膜性能表等?！短烊划a物活性成分分離》實用性和可操作性強，可作為天然產物化學、有機化學、藥物化學、植物化學、分析化學等領域教學與科研工作者及中西藥制藥公司、農業(yè)和食品工業(yè)有關人員的參考書和案頭常用的工具書。

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