RNA研究方法

內(nèi)容概要

這部成功的實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書(shū)的第四版，記錄了核糖核酸研究的最新歷程，擴(kuò)充收集了經(jīng)檢驗(yàn)的、分離和鑒定真核與原核RNA的實(shí)驗(yàn)方案。本書(shū)將重點(diǎn)放在整體的轉(zhuǎn)錄物分析上，包括定量實(shí)驗(yàn)和鑒定可變剪接的起始位點(diǎn)，提供了RNA研究中方案選擇的清晰概念。本書(shū)各章為學(xué)生和研究者提供了清晰易掌握的課程，以使實(shí)驗(yàn)的產(chǎn)出最優(yōu)化：讀者也可選取感興趣的方案，而不失連續(xù)性。書(shū)中豐富的流程圖、圖表和代表性數(shù)據(jù)在研究項(xiàng)目的計(jì)劃、實(shí)施和評(píng)價(jià)階段都特別有用。

書(shū)籍目錄

前言
1 重溫RNA和細(xì)胞生物化學(xué)
 為什么研究RNA?
 RNA是什么?
 多核苷酸的裝配
 RNA的種類
 轉(zhuǎn)錄和中心法則
 研究轉(zhuǎn)錄的重要?jiǎng)又参锬Ｐ?br /> 啟動(dòng)子和調(diào)控元件
 基因和基因組的組織影響轉(zhuǎn)錄
 RNA聚合酶和轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物
 信使RNA
 典型的mRNA分子的拓?fù)鋵W(xué)
5'帽
引導(dǎo)序列
編碼區(qū)
尾隨序列
多聚A尾
細(xì)胞器mRNA
 mRNA的穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)運(yùn)和轉(zhuǎn)歸
 雙順?lè)醋觤RNA
原核mRNA
mRNA的序列和結(jié)構(gòu)影響翻譯
 基因調(diào)控的水平
 來(lái)自單基因座的mRNA的可變剪接
 反式剪接:mRNA的修復(fù)
 小RNA綜觀
 微小RNA對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控
 參考文獻(xiàn)
2 分離RNA的策略
 概述
 純化RNA過(guò)程中的目標(biāo)
 裂解緩沖液配方
 溫和的裂解緩沖液
 方案:用低滲裂解分離胞質(zhì)RNA
 離液性裂解緩沖液
 用含胍的緩沖液分離RNA
 胍-酸-酚抽提技術(shù)
 方案:胍-酸-酚抽提
 密度梯度離心
 氯化銫
方案:氯化銫梯度
 三氟乙酸銫
方案:三氟乙酸銫梯度
 同時(shí)分離RNA和DNA
 方案:同時(shí)分離RNA和DNA
 說(shuō)說(shuō)試劑盒
 硅膠的技術(shù)
用硅膠柱分離胞質(zhì)RNA
 親和介質(zhì)
 其他方法
方案:用十二烷基硫酸鈉和乙酸鉀試劑快速分離RNA
 方案:分離原核RNA
 方案:分離酵母RNA
 提純的RNA的短期和長(zhǎng)期保存
 參考文獻(xiàn)
3 關(guān)于組織的真相
 概述
 組織培養(yǎng)物還是組織?
 細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)
 組織樣品的優(yōu)點(diǎn)
 勻漿法
 用Polytron搗碎
 用Dounce勻漿器勻漿
BeadBeater<sup>TM</sup>技術(shù)
 各種器官和組織的RNA分離的策略
 新鮮組織
 凍存組織
 固定的組織
方案:分離組織RNA的LiCl-尿素法
 方案:從富含類脂樣品分離RNA
 與聚核糖體結(jié)合的mRNA的提純
 方案:聚核糖體mRNA的分離
 在野外收集樣品
 RNA“清洗”法
 從組織分離RNA的困難解決
 參考文獻(xiàn)
4 走向綠色:植物RNA及其分子生物學(xué)
 概述
 RNA的分離和植物的怪異點(diǎn)
 植物細(xì)胞產(chǎn)生的RNA的種類
 方案:從葉中分離RNA
 方案:從樹(shù)皮中分離RNA
 方案:從果實(shí)中分離RNA
 從其他植物組織分離RNA的策略
 從植物組織分離RNA的困難解決
 參考文獻(xiàn)和建議閱讀
5 帶PolyA尾的RNA的分離
 概述
 加PolyA尾
 利用Poly(A)時(shí)的注意事項(xiàng)
 例1
 例2
 選擇帶PolyA尾的分子
 用于提純Poly(A)<sup>+</sup>的磁珠技術(shù)
 Oligo(dT)-纖維素柱層析
方案:大量Poly(A)<sup>+</sup>RNA的提純
不用柱的快速Poly(A)<sup>+</sup>提純
 方案:不用柱的Poly(A)<sup>+</sup>提純
 參考文獻(xiàn)
6 RNA制品的質(zhì)量控制
 概述
 質(zhì)控技術(shù)1:紫外分光光度法和光吸收比
 分光光度法
核酸濃度的測(cè)定
核酸純度的測(cè)定
 非分光光度法
 質(zhì)控技術(shù)2:RNA的電泳圖
 方案
 質(zhì)控技術(shù)3:紫外光投影
 方案
 質(zhì)控技術(shù)4:樣品支持RT-PCR的能力
 質(zhì)控技術(shù)5:Northern分析
 質(zhì)控技術(shù)6:樣品支持體外翻譯的能力
 參考文獻(xiàn)
7 棘手的核糖核酸酶
 概述
 核糖核酸酶活力的去除
 潛伏的RNase污染問(wèn)題
 核糖核酸酶抑制劑的種類
 專一抑制劑
 氧釩核糖核苷絡(luò)合物
RNasin<sup>?</sup>
 非專一抑制劑
 儀器和試劑的準(zhǔn)備
 焦碳酸二乙酯
 代替劑:滅菌水
 過(guò)氧化氫
 氫氧化鈉和十二烷基硫酸鈉
 控制核酸酶活力用的其他試劑
 鹽酸胍
 硫氰酸胍
 十二烷基硫酸鈉
 N-十二烷基肌氨酸
 酚∶氯仿∶異戊醇
 8-羥基喹啉
 氯化銫
 三氟乙酸銫
 蛋白酶K
 “RNAlater”(商品名)
 方案:氧釩核糖核苷絡(luò)合物的合成
 參考文獻(xiàn)
8 嚴(yán)謹(jǐn)度:影響核酸結(jié)構(gòu)的條件
 雙鏈分子的種類
 控制嚴(yán)謹(jǐn)度的重要性
 鹽對(duì)嚴(yán)謹(jǐn)度的影響
 pH對(duì)嚴(yán)謹(jǐn)度的影響
 溫度對(duì)嚴(yán)謹(jǐn)度的影響
 甲酰胺對(duì)嚴(yán)謹(jǐn)度的影響
 尿素對(duì)嚴(yán)謹(jǐn)度的影響
 參考文獻(xiàn)
9 RNA電泳
 概述
 核酸的標(biāo)準(zhǔn)化
 樣品制備
 方案:Poly(A)的標(biāo)準(zhǔn)化
 瓊脂糖凝膠電泳的RNA變性系統(tǒng)
 甲醛變性
 方案:甲醛變性膠
 尿素變性
 方案:尿素變性
 乙二醛、二甲基亞砜變性
 方案:RNA的乙二醛化和電泳
 用非變性膠跑RNA電泳
 分子量標(biāo)準(zhǔn)
 分子大小標(biāo)準(zhǔn)的恰當(dāng)應(yīng)用
 核糖體RNA
 凝膠染色技術(shù)
 溴乙錠
 SYBR綠
 SYBR金
 安全SYBR
 “GelStar”染色劑
 銀染色
 吖啶橙
 亞甲基藍(lán)
 安全考慮和儀器維護(hù)
 第一次跑瓊脂糖電泳:一些提示
 基本詞匯表
 要牢記的幾點(diǎn)
 參考文獻(xiàn)
10 照相記錄和影像分析
 概述
 安全第一
 數(shù)字影像分析
 影像格式
 實(shí)際的考慮
 適用于任何預(yù)算的數(shù)字影像分析
 影像分析學(xué)習(xí)班
 磷屏顯像儀
 傳統(tǒng)的照相記錄方法
 樣品顯影
 濾光
 將電泳圖譜最優(yōu)化的幾點(diǎn)提示
 照相底片和X光片的內(nèi)在局限性
 參考文獻(xiàn)和建議閱讀
11 Northern分析
 概述
 濾膜的選擇
 硝酸纖維素膜
 尼龍膜
 聚偏二氟乙烯膜
 處理和濾膜準(zhǔn)備
 Northern轉(zhuǎn)移技術(shù)
 毛細(xì)現(xiàn)像轉(zhuǎn)移
 “TurboBlotter”轉(zhuǎn)移器
 負(fù)壓轉(zhuǎn)移
 電轉(zhuǎn)移
 堿性轉(zhuǎn)移
 方案:利用被動(dòng)的毛細(xì)擴(kuò)散轉(zhuǎn)移RNA
方案:用TurboBlotter向下轉(zhuǎn)移RNA
 濾膜轉(zhuǎn)移后的處理
 甲醛變性系統(tǒng)
 乙二醛變性系統(tǒng)
選擇1
選擇2
 固定化技術(shù)
 烘烤
 紫外光交聯(lián)
 方案:用紫外光把RNA交聯(lián)在尼龍膜上
 濾膜固定后的處理
 逆Northern分析
 參考文獻(xiàn)
12 核酸探針技術(shù)
 概述
 探針的分類
 選擇標(biāo)記系統(tǒng)
 同位素標(biāo)記
盡可能避免分解問(wèn)題
 非同位素標(biāo)記
 通用染料Cy3和Cy5
 常用的化學(xué)發(fā)光方式
 生物素
 洋地黃苷原
 熒光素
 直接酶標(biāo)記
 DNA探針
 DNA探針的合成
 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)
 隨機(jī)引物反應(yīng)
 缺口轉(zhuǎn)移
 5'末端標(biāo)記
 3'末端標(biāo)記
 反義RNA探針
 RNA探針的特征
 RNA探針的合成
體外轉(zhuǎn)錄
5'末端標(biāo)記
3'末端標(biāo)記
 探針的純化
 探針的保存
 參考文獻(xiàn)
13 核酸雜交的實(shí)踐
 概述
 影響雜交動(dòng)力學(xué)和雙鏈穩(wěn)定性的因素
 溫度
 離子強(qiáng)度
 pH
 探針長(zhǎng)度
 探針濃度
 G+C含量
 錯(cuò)配
 探針復(fù)雜度
 粘度
 甲酰胺
 尿素
 雜交溫度
 長(zhǎng)探針的熔點(diǎn)溫度
 寡核苷酸探針的熔點(diǎn)溫度
 雜交和Northern分析
 預(yù)雜交:濾膜的準(zhǔn)備
 方案:長(zhǎng)探針預(yù)雜交
 探針變性
 雜交
 雜交后的嚴(yán)謹(jǐn)度洗滌
 除去探針和重雜交
 方案:除去探針的通用方法
 參考文獻(xiàn)
14 檢出的原理
 概述
 放射自顯影
 濾膜的處理
 X光片
 安全燈
 曝光時(shí)間
 增感屏
 熒光顯影
 膠片預(yù)閃光
 片匣的種類
 顯影和定影
 方案:放射自顯影
 非同位素方法
 生物素
 洋地黃苷原
 熒光顯影
 直接酶標(biāo)
 用化學(xué)發(fā)光檢出
化學(xué)發(fā)光的底物
 顯色檢出方法
 數(shù)字影像系統(tǒng)
 參考文獻(xiàn)
15 用抗核酸酶技術(shù)定量特定的mRNA
 概述
 基本方法
 探針的選擇
 最優(yōu)化建議
 潛在困難
 方案:用S1核酸酶分析定量轉(zhuǎn)錄物
 方案:用抗核糖核酸酶檢驗(yàn)定量轉(zhuǎn)錄物
 困難解決
 參考文獻(xiàn)
16 核RNA的分析
 概述
 轉(zhuǎn)錄速率的檢驗(yàn)
 與穩(wěn)態(tài)RNA研究的關(guān)系
 核Run-off與核Run-on檢驗(yàn)
 方案:核Run-off檢驗(yàn)
 細(xì)胞的收獲和細(xì)胞核的制備
 制備易破細(xì)胞核的另一方法
 從整塊組織制備細(xì)胞核的另一方法
 轉(zhuǎn)錄物的標(biāo)記和回收
 靶DNA的制備
 雜交用RNA的制備
 雜交后的洗滌和檢出
 方案:核Run-off檢驗(yàn)的另一方法
 方案:抗核酸酶檢驗(yàn)脈沖標(biāo)記轉(zhuǎn)錄檢驗(yàn)
 區(qū)分各種RNA聚合酶的活力
 提取核RNA用于穩(wěn)態(tài)分析
 方案:直接分離核RNA
方案:從富含核糖核酸酶的細(xì)胞中制備核RNA
 核RNA分析的困難解決
 參考文獻(xiàn)
17 cDNA合成
 概述
 cDNA合成——概論
 合成第一鏈的考慮
 逆轉(zhuǎn)錄酶的選擇
 合成第二鏈的考慮
 經(jīng)典方法
 基于PCR的方法
 方案:第一鏈cDNA合成
 評(píng)估cDNA合成的效率
 克隆cDNA
 連接的考慮
 用于連接的酶
 應(yīng)用
 參考文獻(xiàn)
18 逆轉(zhuǎn)錄PCR:一種科學(xué)和技術(shù)形式
 概述
 PCR——概論
 逆轉(zhuǎn)錄PCR——一般研究
 PCR樣品間沾染的防止
 實(shí)驗(yàn)室的設(shè)計(jì)
 程序方法
 阻擋氣溶膠的竅門
 尿嘧啶-N-糖苷酶
 引物設(shè)計(jì)
 基本規(guī)則
T<sub>m</sub>的考慮
估計(jì)T<sub>m</sub>
T<sub>m</sub>的精確計(jì)算
 網(wǎng)上資源
 多重引物的設(shè)計(jì)
 最優(yōu)化手續(xù)
 熱穩(wěn)定聚合酶
 正對(duì)照
 負(fù)對(duì)照
 熱啟動(dòng)PCR
 鎖定的核酸
 降落PCR
 內(nèi)對(duì)照
 關(guān)于轉(zhuǎn)錄調(diào)控
 PCR產(chǎn)物的分析
 逆轉(zhuǎn)錄PCR質(zhì)量控制的注意點(diǎn)
 驗(yàn)證來(lái)自PCR的數(shù)據(jù)的非PCR方法
 相關(guān)技術(shù)
 5'RACEPCR
 5'RLM-RACE
 3'RACE-PCR
 巢式PCR
 長(zhǎng)距離PCR
 單細(xì)胞PCR
 發(fā)夾式接頭PCR
 獵取可變轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)
 方案:第一鏈cDNA合成
 方案:cDNA的PCR擴(kuò)增
 克隆PCR產(chǎn)物
 方案:把平頭PCR產(chǎn)物加A尾
 方案:TA克隆的連接反應(yīng)
 “拓?fù)洹笨寺?br /> 其他擴(kuò)增方法
RNA的線性擴(kuò)增(Eberwine過(guò)程)
 鏈替換擴(kuò)增
 基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)
 連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)
 參考文獻(xiàn)
19 定量PCR技術(shù)
 概述
 靈敏度指數(shù)
 定量研究
 實(shí)時(shí)PCR
 實(shí)時(shí)PCR平臺(tái)
SYBR綠檢驗(yàn)
TaqMan<sup>?</sup>檢驗(yàn)
分子信標(biāo)
“LUX”牌引物
“蝎子”引物
 熔點(diǎn)曲線分析
 內(nèi)對(duì)照
 外對(duì)照
 對(duì)照反應(yīng)的設(shè)置方式
 負(fù)對(duì)照的考慮
 競(jìng)爭(zhēng)PCR:關(guān)鍵的考慮
 競(jìng)爭(zhēng)PCR:所包括的主要步驟
 另一方法:非實(shí)時(shí)競(jìng)爭(zhēng)PCR
 方案:競(jìng)爭(zhēng)PCR
非同源競(jìng)爭(zhēng)物的合成
第1鏈cDNA的合成
競(jìng)爭(zhēng)PCR(一級(jí)擴(kuò)增)
競(jìng)爭(zhēng)PCR(二級(jí)擴(kuò)增)
 影像分析的考慮
 定量PCR技術(shù)的困難解決
 參考文獻(xiàn)
20 功能基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄物總體分析
 概述
 功能基因組學(xué)的定義
 功能基因組學(xué)研究方法的重要性
 常用的功能基因組學(xué)研究方法
 功能基因組學(xué)和經(jīng)典分子生物學(xué)
21 基因表達(dá)的高通量分析
 概述
 什么是微陣列?
 什么是熱圖*?
 微陣列能做什么?
 微陣列不能做什么?
 微陣列分析的主要步驟
 參考RNA
 宏陣列是什么?
 應(yīng)用
 參考文獻(xiàn)
22 整體分析基因表達(dá)的非陣列方法
 概述
 基本問(wèn)題
 消減方法
抑制性消減雜交(SSH)
困難解決
 非消減方法
 mRNA差別顯示
各種方案
 參考文獻(xiàn)
23 RNA干擾:Dicer酶在RISC復(fù)合物中起作用*
 概述
 RNAi的基本名詞
 RNA干擾——它如何工作
 siRNA方法
 shRNA方法
 將siRNA導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法
 miRNA
 siRNA的有效設(shè)計(jì)
 RNAi和轉(zhuǎn)錄物可變剪切
 體外和體內(nèi)問(wèn)題
 RNAi的確認(rèn)
 RT-PCR方法
 Northern雜交分析
 Western雜交分析
 應(yīng)用
 參考文獻(xiàn)
24 基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組和生物信息學(xué)
 概述
 基本名詞
 基因組和基因組學(xué)
 轉(zhuǎn)錄組和轉(zhuǎn)錄組學(xué)
 蛋白質(zhì)組和蛋白質(zhì)組學(xué)
 生物信息學(xué)
 搜索基因——BLAST一下!
 參考文獻(xiàn)
25 RNA一例
 一個(gè)典型實(shí)驗(yàn)?
 靈敏度問(wèn)題
 下一步做什么
 到哪兒去求助
尾聲
 幾粒智慧之珠
附錄A 保留完整準(zhǔn)確的記錄
附錄B 把質(zhì)量轉(zhuǎn)換為摩爾
附錄C 對(duì)分子生物學(xué)家有用的儲(chǔ)存液
附錄D 酚的制備
附錄E 溴乙錠和SYBR綠溶液的棄去
附錄F 用DNase I從RNA樣品中除去DNA
附錄G 用RNase保溫從DNA樣品中除去RNA
附錄H 甲酰胺、甲醛和乙二醛的去離子
附錄I 硅化離心管和玻璃器具
附錄J 貼壁細(xì)胞的胰酶處理方案
附錄K 鹽析法分離高分子量DNA
附錄L 電泳:原理、參數(shù)和安全
附錄M 聚丙烯酰胺凝膠電泳
附錄N 點(diǎn)雜交分析
附錄O 離心是分子生物學(xué)家的主流工具
附錄P 儀器和試劑供應(yīng)商及服務(wù)商選登
附錄Q 有用的國(guó)際單位制單位
附錄R 常用縮寫
附錄S 商標(biāo)摘錄
術(shù)語(yǔ)表
索引

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