表皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)指南

前言

自從二十多年前Rheioward Green和同事們第一次成功地在體外培養(yǎng)了表皮細(xì)胞并使其持續(xù)生長(zhǎng)，我們對(duì)這種細(xì)胞的了解和操作能力得到驚人的提高。然而，多年來在某些范圍內(nèi)一直有一種近乎神秘的觀念，那就是表皮細(xì)胞的研究工作較難開展。盡管和成纖維細(xì)胞相比，這種觀念通常是正確的，但該領(lǐng)域還是在建立這種細(xì)胞類型的許多方法學(xué)方面取得了特別的進(jìn)展。因此，我感到現(xiàn)在正是收集一些有用的實(shí)驗(yàn)方案的時(shí)候，這些實(shí)驗(yàn)方案涵蓋了培養(yǎng)表皮細(xì)胞、富集很早期表皮祖細(xì)胞以及研究表皮細(xì)胞在體內(nèi)和體外定向分化的不同方法和模型?！侗砥ぜ?xì)胞實(shí)驗(yàn)指南》一書并不意味著廣泛收集所有操作表皮細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)方案，而是面向有經(jīng)驗(yàn)的和初學(xué)的表皮生物學(xué)研究者收集他們很容易在自己實(shí)驗(yàn)室重復(fù)的又十分有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)方案。我能完成這本書，與那些非常忠誠(chéng)的撰稿者是分不開的，他們樂意無私分享他們“來之不易”的方法。我感謝他們所有的人。我也想借此機(jī)會(huì)來感謝我多年來的好導(dǎo)師Jane Aubin博士，特別是他在我作為細(xì)胞培養(yǎng)和分化的初學(xué)者時(shí)灌輸給我的極大的熱情和嚴(yán)謹(jǐn)。我同樣感謝Elaine FlJchs博士給了我自己動(dòng)手操作表皮細(xì)胞和小鼠模型進(jìn)行研究的機(jī)會(huì)。沒有他們的支持和給我的機(jī)會(huì)，我不可能在令人興奮的科學(xué)研究領(lǐng)域得以成長(zhǎng)。John Walker博士在我所選擇的科研項(xiàng)目上對(duì)我一直的支持和幫助也非常重要。此外，我感謝所有在Hlamana Press給過我熱心支持的人，特別是Craig Adams。我非常感謝N.Urfe與我進(jìn)行的啟發(fā)性討論。最后，我感謝我偉大的合作者——Tatomy Troy，她無盡的爽朗和熱情的幫助與支持使我很愉快地完成了這本書。

內(nèi)容概要

本書是一本有關(guān)表皮細(xì)胞和表皮干細(xì)胞研究的最新且實(shí)用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)指南。全書共42章，涵蓋了人和小鼠表皮細(xì)胞分離培養(yǎng)的技術(shù)方法以及表皮干細(xì)胞富集、鑒定、培養(yǎng)和體內(nèi)標(biāo)記的技術(shù)方法，詳細(xì)介紹了免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)和基因組學(xué)等最新技術(shù)在研究表皮組織的胚胎發(fā)生、發(fā)育、分化及皮膚疾病中的應(yīng)用，還敘述了表皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的基因修飾( 轉(zhuǎn)染、突變和打靶)、組織工程皮膚的體外構(gòu)建和體內(nèi)移植及毛囊的基因和干細(xì)胞治療等具有廣泛開發(fā)和應(yīng)用前景的重要技術(shù)，對(duì)從事上皮細(xì)胞尤其是表皮細(xì)胞和表皮干細(xì)胞的教學(xué)、科研和開發(fā)人員來說是一本很有價(jià)值的工具書。 　　本書可作為上皮細(xì)胞尤其是表皮細(xì)胞和表皮干細(xì)胞研究、開發(fā)和應(yīng)用的工具書，也可供細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)等有關(guān)領(lǐng)域的教學(xué)、科研人員參考。

作者簡(jiǎn)介

譯者：彭代智 編者：（加拿大）K.圖爾克森（Turksen.K.） 合著者：黃文華 趙雄飛

書籍目錄

中譯本序譯者的話前言第一部分  角質(zhì)形成細(xì)胞和器官培養(yǎng)　第1章  小鼠角質(zhì)形成細(xì)胞的原代培養(yǎng)　第2章  原代成年小鼠角質(zhì)形成細(xì)胞的連續(xù)培養(yǎng)　第3章  無基質(zhì)貼附下的角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)　第4章  基因修飾的飼養(yǎng)細(xì)胞在角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用　第5章  胎鼠皮的器官培養(yǎng)及其在形態(tài)發(fā)生分子機(jī)制研究中的應(yīng)用　第6章  分析培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞體外和體內(nèi)分化功能的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀〉?章  工程化人體皮膚的體外構(gòu)建第二部分  表皮干細(xì)胞　第8章  表皮干細(xì)胞的體內(nèi)標(biāo)記和分析　第9章  體外形成克隆的小鼠角質(zhì)形成干細(xì)胞的收集和檢測(cè)方法　第10章  人角質(zhì)形成干細(xì)胞的FACS富集　第11章  上皮干細(xì)胞的分離、鑒定與培養(yǎng)　第12章  角蛋白19作為體內(nèi)和體外干細(xì)胞的標(biāo)志第三部分  表皮分化的分析　第13章  免疫定位技術(shù)在表皮研究中的應(yīng)用　第14章  以逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)分析表皮細(xì)胞　第15章  表皮發(fā)育過程中基因誘導(dǎo)和屏障形成的全組織包埋分析　第16章  斑馬魚早期表皮發(fā)育的分析　第17章  E2F因子在表皮細(xì)胞分化中的作用　第18章  表皮中HOX同源盒結(jié)構(gòu)域蛋白和基因轉(zhuǎn)錄物的分析　第19章  表皮的凋亡　第20章  橋粒蛋白在凋亡表皮細(xì)胞中的命運(yùn)　第21章  角質(zhì)形成細(xì)胞表達(dá)間隙連接蛋白43的流式細(xì)胞術(shù)分析　第22章  角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)物內(nèi)問質(zhì)金屬蛋白酶-9和金屬蛋白酶組織抑制劑-1的檢測(cè)　第23章  毛囊上皮細(xì)胞表達(dá)S100蛋白的特征　第24章  角質(zhì)化細(xì)胞包膜的免疫電子顯微鏡分析和抗原修復(fù)第四部分  表皮功能分析的方法及途徑　第25章  用免疫化學(xué)方法進(jìn)行人工皮膚的細(xì)胞動(dòng)力學(xué)分析　第26章  多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)分析正常及過度增生性皮膚的增殖、分化和炎癥　第27章  細(xì)胞數(shù)目的DNA熒光測(cè)定法　第28章  角質(zhì)形成細(xì)胞的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)　第29章  四環(huán)素調(diào)控下表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的基因表達(dá)　第30章  角質(zhì)形成細(xì)胞中寡核苷酸介導(dǎo)的基因打靶　第31章  人SPRR基因家族啟動(dòng)子分析　第32章  大片段PAC重組載體在角質(zhì)形成細(xì)胞中的穩(wěn)定整合　第33章  小鼠表皮的定向體細(xì)胞突變　第34章  蛋白質(zhì)相互作用的研究方法　第35章  識(shí)別皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的重組噬菌體展示抗體的分離　第36章  發(fā)育過程中組織特異性DNA甲基化模式的分析　第37章  人角質(zhì)形成細(xì)胞和表皮的基因表達(dá)系列分析　第38章  DermArray尼龍膜DNA微陣列應(yīng)用于皮膚病基因表達(dá)譜的研究方法　第39章  表皮內(nèi)雙光子熒光成像及活性氧檢測(cè)第五部分  移植與基因治療　第40章  人組織工程皮膚的體內(nèi)移植　第41章  利用活體電穿孔進(jìn)行表皮定向的基因轉(zhuǎn)移　第42章　毛囊的基因及干細(xì)胞治療索引彩圖

章節(jié)摘錄

插圖：很多不同的病毒載體可用于高效的基因傳遞。為了取代有缺陷的基因，病毒載體必須包括整個(gè)基因或，以及一些對(duì)基因表達(dá)非常重要的調(diào)控區(qū)的完整拷貝。整合病毒顆粒（逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒和腺相關(guān)病毒）介導(dǎo)的基因傳遞，可提供長(zhǎng)期表達(dá)，因?yàn)檗D(zhuǎn)入的基因可永久整合到宿主染色體。盡管由病毒介導(dǎo)的基因向臨床應(yīng)用推進(jìn)上已取得令人難忘的進(jìn)展，但也存在不少問題。例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒感染需要細(xì)胞分裂，因此限制了對(duì)慢分裂周期的干細(xì)胞的感染，而且也一直難以產(chǎn)生出穩(wěn)定的高滴度病毒，以便有效地用于體內(nèi)感染。一些研究還表明盡管載體DNA完好存在，但病毒啟動(dòng)子所驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)入基因表達(dá)卻逐漸失活。還有一涉及安全的憂慮是可能產(chǎn)生具有復(fù)制活性的逆轉(zhuǎn)錄病毒，例如，病毒的隨機(jī)整合還能激活致癌基因或使腫瘤抑制基因失活_1川。雖然腺病毒傳遞系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)在于其感染不需要靶細(xì)胞分裂且可產(chǎn)生高滴度的病毒，但是腺病毒載體更易于感染不復(fù)制的終末分化細(xì)胞，因而限制了其在這些細(xì)胞過渡時(shí)期的表達(dá)。此外，感染的細(xì)胞可成為免疫系統(tǒng)的靶點(diǎn)而被清除出體外，高滴度的腺病毒用于臨床可引起急性免疫反應(yīng)，對(duì)宿主有害。考慮到使用病毒載體面臨的困難，開展用于皮膚基因治療的其他方式是非常必要的。已建立出幾種通過同源重組糾正突變的基因打靶策略，這樣在糾正突變的同時(shí)又保持了對(duì)于基因的適當(dāng)表達(dá)和調(diào)控很重要的復(fù)雜基因組結(jié)構(gòu)。采用雙鏈DNA的傳統(tǒng)基因打靶策略有可能取代或敲除染色體的遺傳信息，而通過篩選很少成功的靶向產(chǎn)物可以將這一策略應(yīng)用于胚胎干細(xì)胞另一可選擇的方法是通過偶聯(lián)活性化學(xué)基團(tuán)的可形成三螺旋結(jié)構(gòu)的寡核苷酸進(jìn)行靶向基因突變，可形成三螺旋結(jié)構(gòu)的寡核苷酸識(shí)別靶向堿基附近的序列，活性基團(tuán)化學(xué)修飾靶向核苷酸或?qū)е翫NA修復(fù)。小片段同源替代策略采用300～400個(gè)堿基的單鏈核苷酸可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生約1％的同源替代口引。還有一種方法包括由兩種不同的結(jié)構(gòu)域組成的雙功能寡核苷酸，三螺旋區(qū)域可結(jié)合目的堿基附近的序列，修復(fù)結(jié)構(gòu)域含有與目的堿基錯(cuò)配的序列。近年來，腺相關(guān)病毒載體已被用來修飾同源染色體的序列，其在正常人細(xì)胞次黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶（HPRT）位點(diǎn)上的打靶效率接近。盡管這些方法的每一種成功使用的案例有限，但由于同源重組的效率仍然很低，因而使用仍受到嚴(yán)格限制。目前，我們實(shí)驗(yàn)室著重開展使用相對(duì)短的單鏈寡聚脫氧核苷酸針對(duì)單個(gè)點(diǎn)突變的位點(diǎn)特異性校正的實(shí)驗(yàn)策略。這些研究包括建立敏感及可重復(fù)的分析方法以評(píng)價(jià)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中基因校正的頻率，以及提高打靶頻率的機(jī)制性研究。針對(duì)這些目標(biāo)，已經(jīng)建立了兩種分析系統(tǒng)通過基因校正、突變的及突變的酪氨酸酶用來檢測(cè)表型的改變。兩種系統(tǒng)都可證實(shí)在一些哺乳動(dòng)物細(xì)胞的游離基因及染色體中通過進(jìn)行基因校正，如、原代人角質(zhì)形成細(xì)胞、黑素細(xì)胞及小鼠胚胎干細(xì)胞。在最近的實(shí)驗(yàn)中，我們?cè)O(shè)計(jì)了分別改變酪氨酸酶及r砌基因的兩種DDN，它們能夠?qū)е聠蝹€(gè)白化小鼠黑素細(xì)胞中這兩種基因同時(shí)被修正。我們的結(jié)果表明在一個(gè)具有“修復(fù)一活性”細(xì)胞核中如果同時(shí)存在兩種DNA，則雙重打靶事件發(fā)生的頻率相對(duì)較高。這一策略可以使用篩選操作來克服基因校正的低頻率和目前基于寡核苷酸基因打靶的限制。

編輯推薦

《表皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)指南》是“十一五”國(guó)家重點(diǎn)圖書出版規(guī)劃項(xiàng)目。

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